Der Aktin Nanomotor

Das Ziel dieses Projekts ist die Aufklärung der 3-dimensionalen Anordnung von Aktinfilamenten bei der auf Aktin basierenden Bewegung. Warum ist das wichtig? Aktinfilamente sind der Motor für die Bewegung von wandernden Zellen während der Entwicklung und Wiederherstellung von Geweben und bei der Bildung von Metastasen durch Tumorzellen. Pathogene wie Listeria monocytogenes und das Vaccinia Virus verwenden Aktin als Antrieb um sich verborgen vor dem Immunsystem von infizierten zu nicht-infizierten Zellen zu verbreiten. Daher ist es essentiell den Mechanismus der auf Aktin beruhenden Bewegung zu entschlüsseln, um sowohl normale als auch Krankheitsprozesse zu verstehen. Aktin-Polymerisation wird an Zellmembranen, den Lamellipodien, von spezifischen Nukleationsproteinen (dem Arp2/3 -Komplex und den Forminen) eingeleitet, und durch andere Faktoren, wie den Ena/VASP-Proteinen, gesteigert. Aber wie ist das Aktin-Netzwerk der Lamellipodien organisiert und verknüpft und welche strukturellen Neuanordnungen begleiten die Anheftung an der Extrazellulären Matrix, durch die die nötige Traktion hergestellt wird? Und verwenden Pathogene die Mechanismen der Lamellipodien um sich im Cytoplasma fortzubewegen? Diese Fragen können nur mit dem Erlangen des Wissens über die 3-dimensionale Struktur des Aktin-Netzwerks und der Aktin/Membran-Grenzschicht beantwortet werden, und zwar unter Bedingungen, bei der die Aktinfilamente zuverlässig in ihrer ursprünglichen Form erhalten bleiben Es werden drei Innovationen vorgeschlagen um diese Ziele zu erreichen: 1) Negativfärbungselektronenmikroskoptomografie: Wir haben unlängst entdeckt, dass bei Zellen, die in tiefer Negativfärbung eingebettet sind, die Dreidimensionalität und die Aktinfilament-Substruktur in den Lamellipodien erhalten bleibt. Wir werden diese neue Technologie ausschöpfen um die Architektur der Lamellipodien zu klären. 2) Nanostab-Bewegung: In einem multidisziplinären Ansatz werden wir Nanostäbe (10 nm im Durchmesser), die in vitro von Aktinfilamenten angetrieben werden, für die strukturelle Analyse des Aktin-Motors verwenden. Parallel dazu werden wir Tieffärbungselektronenmikroskoptomografie / 3D Visualisierung an Vaccinia Virus infizierten Zellen anwenden um den Mechanismus klären, der die Pathogene antreibt. 3) Korrelative Visualisierung lebender Zellen und Kryo-Elektronentomografie. Wir werden eine einzigartige Methode entwickeln um Zellen in einer bekannten Phase ihrer Bewegung zu erfassen und in gläsern-gefrorenen Zustand für die Strukturanalyse zu bringen. Zu erwarten sind neue Erkenntnisse in die strukturellen Grundlagen der Aktin-basierten Bewegung, welche zu einem tieferen Verständnis der fundamentalen Prozesse, die der Zellwanderung zugrunde liegen, führen.

Ohne Bewegung gibt es kein Leben, dies gilt auf allen Ebenen metazoischen Lebens, angefangen von einzelnen Zellen bis hin zum gesamten Organismus. Während der Embryonalentwicklung migrieren einzelne Zellen von den Keimblättern ab und legen dadurch den Körperbauplan fest. Im adulten Gewebe spielen migrierende Zellen eine Hauptrolle in der Immunabwehr und in der Wundheilung. Pathologische Vorgänge, wie die Ausbreitung von Tumoren oder Arteriosklerose, beruhen ebenfalls auf der Zellmigration. Das Protein Actin trägt grundlegend zur Zellfortbewegung bei und daher haben wir uns in unseren Studien darauf konzentriert den Mechanismus zu verstehen, mit dessen Hilfe Actin Bewegung ermöglicht. Nicht nur Zellen verwenden Actin um sich fortzubewegen, sondern auch einige Bakterien und Viren nutzen die Actinmaschinerie der Wirtszellen um ihre eigene Ausbreitung (innerhalb des Gewebes) zu optimieren. Dazu rekrutieren sie Actin und dessen Co-Faktoren um sich von ihnen durchs Zytoplasma schieben zu lassen. Dies ähnelt einem Raketenantrieb, wobei das Pathogen, angetrieben von einem Actin-Kometenschweif, von einer Zelle zur nächsten überspringt ohne dabei vom Immunsystem erkannt zu werden. Das Hauptziel unseres Projektes war es, herauszufinden, wie Zellen Actinfilamente zur Fortbewegung nutzen. Um diese Aufgabe zu meistern, machten wir Gebrauch von einer neuen Technologie, nämlich der Elektronenmikroskop Tomographie (auch Elektronentomographie genannt). Dies ermöglichte es uns, die 3-dimensionale Anordnung subzellulärer Strukturen auf wenige Nanometer genau aufzulösen. Indem wir Lichtmikroskopie und Elektronentomographie kombinierten, entdeckten wir, dass die dünnen flächigen Regionen (Lamellipodien) im vorderen Bereich von migrierenden Zelle durch Actinfilamenten initiiert und aufgebaut werden. Kurz gesagt bestehen Lamellipodien aus einem Geflecht von Filamenten, wobei Proteinkomplexe Verzweigungen der Actinfilamente ermöglichen und stabilisieren und somit das Netzwerk aufbauen. Zudem wurden mathematische Modelle entwickelt, welche die Entstehung solcher Lamellipodien beschreiben. Zur Erforschung der actinabhängigen Ausbreitung von Krankheitserregern haben wir uns auf Mitglieder der Baculovirusfamilie konzentriert, eine Gruppe von Insektenviren. Der Baculovirus zählt zu den kleinsten Pathogene mit Actinantrieb und ist daher für hochauflösende bildgebende Verfahren hervorragend geeignet. Ebenso wie alle anderen Krankheitserreger, welche sich dem actinabhängigen Bewegungsapparat der Zellen bedienen, generiert auch der Baculovirus einen Kometenschweif aus Actin und bewegt sich so durch die infizierten Zellen. Mit Hilfe der Elektronentomographie konnten wir den strukturellen Aufbau des Kometenschweifs auflösen. Wir lieferten die ersten 3-dimesionalen Bilder des Kometenschweifs, wobei erkennbar wird, dass die Antriebskraft auf dem fischgrätenähnlichen Aufbau der Actinfilamenten beruht. Die Filamente werden von denselben Verzweigungen zusammengehalten, wie sie es auch im Lamellipodium gibt. Auch hier wurde ein mathematisches Modell entwickelt, welches die Fortbewegung des Erregers simuliert und fähig ist, sowohl die beobachteten Strukturen des Actinschweifs als auch die zurückgelegten Pfade des Virus in den infizierten Zellen zu reproduzieren.Alles in allem haben wir durch unsere Entdeckungen, bezüglich der Organisation von Actinfilamenten in unterschiedlichen beweglichen Systemen, erkannt, wie während diverser biologischer Prozesse polymerisierendes Actin eine Schubkraft erzeugen kann. Unsere Expertise in der Elektronentomografie des Zytoskeletts wurde auch in zahlreichen Kollaborationen genutzt, wobei wir die Rolle von unterschiedlichen Proteinen und Proteinkomplexen, in actinbasierenden Vorgängen, erforschten.