Kohlenhydrat-Engineering von S-Schichten für Bioaktivität

Kohlenhydrate sind entscheidend für eine Vielzahl biologischer Prozesse. Zellen verwenden sie zur Kommunikation, Bakterien und Viren verwenden sie zur Auslösung von Infektionen und Krebszellen verwenden sie zu ihrer Verbreitung im Körper. Kohlenhydrat-vermittelte Phänomene können häufig unter Biostimulation und Biotargeting zusammengefasst werden. Dabei sind die Kohlenhydrate oft an Proteine gebunden. Demnach können maßgeschneiderte Kohlenhydrate an Proteinen, die durch die junge Technologie des Kohlenhydrat-Engineering hervorgebracht werden, maßgeblich biologische Systeme beeinflussen und kontrollieren. Das Maßschneidern von Glykoproteinen in Bakterien ist jüngsten Erkenntnissen zufolge besonders vielversprechend, da Bakterien prozeßökonomisch arbeiten und in der Lage sind, einheitliche Glykoproteine zu erzeugen. Obwohl die Strategie des cell surface display von Proteinen in der grundlagen- und anwendungsorientierten Forschung schon lange geschätzt wird, wurde sie bisher noch nicht für Kohlenhydrate umgesetzt. Im vorliegenden Projekt soll in einem biomimetischen Ansatz bakterielles Kohlenhydrat-Engineering mit der multivalenten Präsentation von maßgeschneiderten Kohlenhydraten an Zelloberflächen kombiniert werden. Basis ist das S- Schichtglykoprotein des Gram-positiven Bakteriums Paenibacillus alvei CCM 2051T, das durch Selbstorganisation eine 2D kristalline Matrix mit nanometerskaliger Genauigkeit ausbildet, wobei die Kohlenhydrate zur Umgebung hin orientiert sind. Die Ähnlichkeit der Biosyntheseabläufe verschiedener bakterieller Kohlenhydrate ist die Basis für die Kombinierbarkeit einzelner Module und somit für das Maßschneidern von S Schichtglykoproteinen. Zur Charakterisierung ausgewählter Schlüsselmodule der P. alvei S-Schichtglykosylierung und zur Testung unserer Hypothese, beinhalten unsere Forschungsziele. A) Analyse der nativen Tyrosin-O Glykosylierungsstellen des S- Schichtproteins SpaA. B) Erste Untersuchungen zu Kettenlängenregulation, Export und Oligosaccharid:Protein- Transfer. C) Ausstattung des S-Schichtproteins mit diversen fremden Kohlenhydraten als proof of principle, wobei dafür Mutanten mit unterschiedlichen Defekten in der S-Schichtproteinglykosylierung verwendet werden. D) Ausweitung des Glykosylierungspotentials des S-Schichtproteins SpaA durch den Austausch der nativen O Glykosylierungsstelle(n) durch bakterielle N Glykosylierungsstelle(n), die dann durch die dazugehörige Glykosylierungs-maschinerie erkannt wird. Das zu etablierende System erlaubt die gezielte Kontrolle über Position, Anzahl und Art der präsentierten Kohlenhydrate. Es stellt einzigartige Rahmenbedingungen für Studien zu Bio-stimulation und Bio-targeting durch Kohlenhydrate in einem dynamischen, biomimetischen Umfeld dar, und kann bedingt durch Multivalenz, zur Steigerung von Affinität und Spezifität zwischen Kohlenhydraten und ihren Liganden beitragen. Das Projekt folgt dem derzeitigen Trend zur nanometerskaligen Organisation biologischer Funktionen für die Entwicklung neuer Konzepte für life und non-life sciences und zeigt zukünftige Möglichkeiten für die Translation der glykobiologischen Forschung in die Bereiche der Humanmedizin und des Design neuartiger Biomaterialien auf.

Kohlenhydrate sind entscheidend für eine Vielzahl biologischer Prozesse wie Biostimulation und Biotargeting. Demnach können maßgeschneiderte Kohlenhydrate, die durch Kohlenhydrat-Engineering hervorgebracht werden, biologische Systeme beeinflussen und kontrollieren. Das Maßschneidern von Kohlenhydraten in Bakterien ist attraktiv, da diese einfach kultivierbar sind und prozess-ökonomisch arbeiten. Die Präsentation von biologisch- aktiven Epitopen auf Bakterien ist eine vielversprechende Strategie.In einem biomimetischen Ansatz sollte bakterielles Kohlenhydrat-Engineering mit der multi- valenten Präsentation von maßgeschneiderten Kohlenhydraten kombiniert werden. Basis ist das S-Schichtglykoprotein des Bakteriums Paenibacillus alvei (Pa), das durch Selbst- organisation eine 2D kristalline Matrix mit nanometerskaliger Genauigkeit ausbildet. Die Ähnlichkeit der der Biosyntheseabläufe für verschiedene Kohlenhydrate ist Voraussetzung für die Kombinierbarkeit einzelner Module.Wesentlichen Ergebnisse aus diesem Projekt sind: (i) Etablierung eines (Glyko)protein Co- Displaysystems basierend auf der Pa S-Schicht und einem neuen Zelloberflächenprotein. (ii) Aufklärung eines neuartigen Mechanismus zur Verankerung von Proteinen an Bakterienzellen unter Einbeziehung sogenannter S-Schicht-homologer Proteindomänen, die zwei unterschiedliche Komponenten der Zellwand binden. (iii) Charakterisierung der Kohlen- hydrat:Proteintransferase aus der Pa S-Schichtprotein-Glykosylierung als Schlüsselmodul, wobei das Enzym spezifischer ist als vergleichbare Enzyme und zudem nur S-Schichtprotein glykosylieren dürfte das nativ gefaltet wurde. (iv) Nachweis eines Pa Glykosylierunssystems für Falgellin, welches neue Ansätze für die Präsentation von Epitopen eröffnet. (v) Modifikation der Pa S-Schichtglykane mit Sialinsäure durch metabolisches Engineering. (vi) Charakterisierung der glykosylierten S-Schicht von Lactobacillus buchneri als gesundheitlich unbedenkliche Präsentations-Matrix und Verwendung derselben zur Konstruktion einer Modellvakzine. Dabei wurde ein neuartiges Glykosylierungssystem für L. buchneri entdeckt. Das etablierte System erlaubt die gezielte Kontrolle über Position, Anzahl und Art der präsentierten Kohlenhydrate. Es stellt einzigartige Rahmenbedingungen für Funktionsstudien von Kohlenhydraten in einem dynamischen, biomimetischen Umfeld dar, und kann bedingt durch Multivalenz, zur Steigerung von Affinität und Spezifität zwischen Kohlenhydraten und Liganden beitragen. Das Projekt folgt dem derzeitigen Trend zur nanometerskaligen Organisation biologischer Funktionen für die Entwicklung neuer Konzepte für life- und non-life sciences und zeigt zukünftige Möglichkeiten für die Translation der mikro- und glykobiologischen Forschung in die Bereiche der Humanmedizin und des Design neuartiger Biomaterialien auf.