Regulatoren der Signalübertragung an das Nukleosom

Eukaryotische Zellen reagieren auf externe Signale mit Veränderungen ihres Genexpressionsprogramms. Extrazelluläre Signale werden an der Zelloberfläche empfangen und in den Zellkern übertragen, wo dadurch aktivierte Transkriptionsfaktoren die Expression definierter Zielgene mit Hilfe von assoziierten Chromatin- modifizierenden Enzymen regulieren. Aktivierung von Stress- und Mitogen-aktivierten Kinasen führt letztendlich zu spezifischer Markierung der Nukleosomen durch Phosphorylierung von Serin 10 am Histon H3. Im Laufe der letzten Jahre wurde H3S10-Phosphorylierung als Teil der sogenannten "nukleosomalen Response" mit der transkriptionellen Aktivierung zahlreicher Gene in Zusammenhang gebracht. Weiters wurde gezeigt, dass Histon H3 durch verschiedene Stimuli an Serin 28 phosphoryliert wird. Vor Kurzem haben wir und andere gezeigt, dass 14-3-3 Proteine H3S10ph spezifisch erkennen und binden. Interessanterweise führt zusätzliche Azetylierung benachbarter Lysinreste zu einer signifikanten Erhöhung der Affinität von 14-3-3 für S10-phosphoryliertes Histon H3, was den Schluss zulässt, dass 14-3-3 multiple Histonmodifikationen erkennen kann. 14-3-3 wird in Folge von Stress- und Wachstumsfaktorsignalen zu Promotoren von spezifischen Zielgenen rekrutiert and die Gegenwart von 14-3-3 ist sogar unerlässlich für die Aktivierung dieser Gene. Der Mechanismus, der der transkriptionellen Aktivierung der Zielgene zu Grunde liegt, ist allerdings noch nicht aufgeklärt. Während der letzten Jahre haben wir mehrere Antikörper gegen 14-3-3 zeta und spezifische Histonmodifikationen sowie Zelllinien, die TAP-getaggtes 14-3-3 und myc-getaggtes Histon H3.3 exprimieren, hergestellt. Mit Hilfe dieser Reagenzien planen wir die Bedeutung der Histon H3 Phosphorylierung und deren Erkennung durch das 14-3-3 Protein in Mausfibroblasten zu untersuchen. Durch Identifikation von 14-3-3-assoziierten Faktoren, Knockdown-Studien und Chromatinimmun- präzipitations-Assays werden wir die Rolle von 14-3-3 in der Genregulation definieren. Mittels der kürzlich entwickelten Methode des ChIP-sequencings werden wir eine Kartierung des Mausgenoms für die S10- und die S28-Phosphorylierung an Histone H3 durchführen. Dieselbe Methode wird uns in Kombination mit Genexpressionsprofilen ermöglichen, die Konsequenzen der Phosphorylierung von Histon H3 und deren Erkennung durch 14-3-3 für die Genregulation zu bestimmen. Die Resulate sollten bedeutend zu unserem Verständnis der transkriptionellen Regulation durch kombinatorische Histonmodifikationen beitragen. Schließlich könnten unsere Resultate Rückschlüsse auf die Existenz eines postulierten Protein-Codes, der durch kombinatorische Modifikationen zu unterschiedlichen Funktionen ein und desselben Proteins führt, zulassen.

In diesem Projekt haben wir ein Gesamtbild der transkriptionellen Stressantwort in Säugetierzellen gezeichnet. Externe Signale werden von unseren Zellen über Signalkaskaden in den Zellkern weitergeleitet, wo sie durch Änderung des Genexpressionsprogramms eine Anpassung der Zelle an veränderte äußere Bedingungen ermöglichen. In Folge von Stress wird ein Histon, das Verpackungsprotein unseres Erbmaterials, durch Phosphorylierung markiert. Mit Hilfe von neuartigen Methoden konnten alle Gene in der Zelle, die so markiert wurden, identifiziert werden. Es zeigte sich, dass die Markierung der Gene zu einer Öffnung der Verpackung der Gene und somit zur stressabhängigen Aktivierung dieser Gene führt. Die Markierung der Histone durch Phosphorylierung stellt Teil des sogenannten Histon-Codes dar und ermögliche die gezielte Aktvierung einer maßgeschneiderten Reaktion auf äußere Signale. Diese Arbeit ist im Speziellen zum Verständnis der Bedeutung der Histonphosphorylierung für die Genregulation und im Allgemeinen ein wichtiger Beitrag zur Entzifferung des Histon-Codes.