Der allosterische Mechanismus der KIX-Domäne

Eine Vielzahl biologisch wichtiger Prozesse auf molekularer Ebene wird durch allosterische Wechselwirkungen reguliert. Allosterie ist durch Mechanismen bedingt, welche Information über die Anwesenheit eines Bindungspartners zwischen räumlich getrennten Positionen innerhalb eines Proteins oder eines Proteinkomplexes kommunizieren, wobei der Informationsfluss wird in den meisten Fällen mit gezielten Änderungen der Raumstrukturen dieser Proteine einhergeht. Während die allosterischen Mechanismen von Proteinen, welche aus separaten Untereinheiten bestehen, vielfach bekannt sind, ist über interne Kommunikationsmechanismen innerhalb einzelner Proteineinheiten nur wenig bekannt. Im Rahmen unseres FWF-Einzelprojekts streben wir eine umfassende und quantitative Beschreibung des allosterischen Mechanismus der KIX-Domäne des Transkriptions-Co-aktivators CBP (CREB-binding protein) an. Die KIX-Domäne reguliert die Affinitäten ihrer Bindungspartner, Transkriptionsfaktoren, durch paarweisen Informationstransfer zwischen ihren Ligandenbindungsstellen. Aufgrund der dynamischen Natur interner Kommunika-tionsprozesse in Proteinen können die zu Grunde liegenden Mechanismen mit Hilfe NMR- spektroskopischer Relaxationstechniken quantitativ und mit atomarer Auflösung charakterisiert werden. Verschiedene dynamisch NMR-Spektroskopische Methoden erlauben die experimentelle Untersuchung räumlicher Strukturänderungen und ermöglichen somit die direkte Beobachtung des strukturellen Umwandlungsprozess, durch welchen die KIX-Domäne die Anwesenheit eines Bindungspartners intern kommuniziert. Diese Methoden liefern direkte Information sowohl über die Geschwindigkeit intramolekularer Kommunikation, als auch über ihren Übertragungsweg im Inneren des Proteinmoleküls. Um detaillierte Einblicke in die mechanistischen Details allosterischer Kommunikation der KIX-Domäne zu erhalten, werden wir dynamisch NMR-spektroskopische Experimente mit verschiedenen biophysikalischen Techniken kombinieren, wie etwa isothermer Titrationskalorimetrie, Proteinstrukturbestimmungen und Mutationstechniken. Durch die Verknüpfung dieser unterschiedlichen Techniken erhoffen wir uns unfassenden Einsichten in den molekularen Mechanismus durch welchen die KIX-Domäne Kooperativität zwischen Transkriptionsfaktoren vermittelt, und somit einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der Regulierung der Gen-Transkription.

Im vorliegenden Projekt des Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung FWF wurde die molekulare Wirkungsweise eines Proteins in atomarer Auflösung charakterisiert. Proteine sind jene Moleküle, welche die Mehrzahl der lebensnotwendigen Prozesse in Zellen bewältigen. Eine spezielle Funktion von Proteinen beinhaltet zum Beispiel die Gruppierung zu aktiven "Komplexen", welche sodann eine biologische Aufgabe erfüllen. Untersuchungen zu den Mechanismen des Aufbaus dieser Proteinkomplexe sind von fundamentalem biologischen Interesse, vor allem auch angesichts des bekannten Zusammenhangs mit einer Anzahl von weit verbreiteten Krankheiten. Ein Beispiel für solche Proteinkomplexe stellt die RNA-Polymerase dar, welche für die Synthese von RNA und somit für das Ablesen der genetischen Information mit verantwortlich ist. Mit Hilfe kernmagnetischer Resonanz (NMR) Spektroskopie in Lösung konnten wir zeigen, dass das Protein KIX, welches gemeinsam mit weiteren Proteinkomponenten am Aufbau der RNA-Polymerase beteiligt ist, einen wesentlichen Beitrag zur Stabilität dieses Komplexes beiträgt. Die Verknüpfung von unterschiedlichen experimentellen Ansätzen ermöglichte die Quantifizierung der strukturellen Stabilität von unterschiedlichen Modell-Komplexen von KIX mit Wechselwirkungspartnern. Es konnte gezeigt werden, dass ein messbarer Beitrag des Proteins KIX zur Ausbildung dieser Wechselwirkungen in der strukturellen Flexibilität dieses Proteins begründet liegt. Um eine möglichst authentische Beschreibung dieses Mechanismus zu ermöglichen, wurden in diesem Projekt ausschließlich Techniken verwendet, die eine experimentelle Untersuchung der Proteinflexibilität mit atomarer Auflösung erlauben.Zusätzlich wurde die dreidimensionale Struktur von KIX im Komplex mit Wechselwirkungspartnern in Lösung untersucht. Diese Experimente zeigen, dass die strukturellen Eigenschaften dieses Proteins im Einklang mit seiner oben erwähnten Flexibilität stehen, jedoch die Flexibilität in der dreidimensionalen Struktur zeitlich ausgemittelt erscheint. Unsere Ergebnisse zeigen somit die Wichtigkeit von Flexibilitätsmessungen auf atomarer Ebene für das Verständnis von Wechselwirkungen zwischen Proteinmolekülen auf.