Paenibacillus alvei S-Schicht Glykosylierung

Paenibacillus alvei CCM 2051T ist ein Gram-positives, mesophiles Bakterium, das vollständig mit einer glykosylierten S-Schicht bedeckt ist. Es ist das bisher einzige Eubakterium, an dem eine gezielte genetische Veränderung des Glykosylierungsmusters des S-Schichtproteins durchgeführt werden kann - und somit - ein interessanter Kandidat für die Herstellung von massgeschneiderten, glykosylierten S-Schichtproteinen für Anwendungen im Bereich der Nanobiotechnologie. Die am Glykosylierungsprozeß beteiligten Gene sind in einem Gencluster von ca. 24 kb organisiert, dessen vollständige Sequenz seit kurzem bekannt ist. In Datenbank- Sequenzvergleichen wurden neben Glykosyltransferasen, die eine Schlüsselrolle beim Aufbau der S- Schichtglykanketten spielen, auch Gene zur Biosynthese von Nukleotid-aktivierten Zuckern und solche zum Transport und Ausschleusen der im Zytoplasma synthetisierten S-Schichtglykane identifiziert. Im vorgeschlagenen Forschungsprojekt sollen drei verschiedene Themenschwerpunkte untersucht werden. 1. Ein Bereich zielt auf die Expression und funktionelle Analyse der bisher nicht charakterisierten Glykosyltransferase WsfC ab, die aufgrund von drei unterschiedlichen Domänen multifunktionell und an der Biosynthese der am Adaptersaccharid des S-Schichtglykans gebundenen Seitenkette beteiligt sein könnte. Da Enzyme, die an der Verzweigung von bakteriellen Oligosacchariden beteiligt sind bisher kaum charakterisiert wurden, stellen diese Arbeiten wissenschaftliches Neuland dar. Der biochemische Funktionsnachweis dieses Enzyms bedeutet einen wichtigen Schritt für das geplante "Glycanengineering" mit S-Schichtglykoproteinen. Basierend auf seiner Wasserlöslichkeit soll an diesem Enzym der Wirkungsmechanismus auch mittels Röntgenstrukturanalyse in Zusammenarbeit mit Prof. H.M. Holden, University of Wisconsin, untersucht werden. 2. Da sich bei P. alvei sowohl ein vollkommen wasserlösliches rekombinantes S-Schichtprotein wie auch ein komplett löslicher S- Schichtglykoprotein / sekundärer Zellwandpolymer-Komplex isolieren ließen, sind auch von diesen Komponenten Röntgenstrukturanalysen geplant. Aus den Untersuchungsergebnissen erwarten wir erstmals 3D Strukturinformationen über ein intaktes S-Schichtprotein sowie Informationen über die Wechselwirkung des Zellwandpolymers mit dem S-Schichtglykoprotein und damit seiner Anbindung an die Zellwand des Bakteriums. 3. Im P. alvei S-Schichtglykoprotein liegen Tyrosin-gebundenen S-Schichtglykane vor. Diese O-glykosidische Bindung stellt vermutlich eine stabilere Verknüpfung der Zuckerketten als in normalen O-Glykanen dar; daher soll in einer systematischen Untersuchung deren chemische Stabilität analysiert werden. Eine stabilere Verknüpfung der Glykane an die S-Schichtprotein-Matrix kann das zukünftige Anwendungspotenzial von maßgeschneiderten, glykosylierten S-Schichtproteinen im Bereich der Nanobiotechnologie entscheidend erweitern.

Die Ziele des kürzlich abgeschlossenen Forschungsprojekts P22791-B11 waren die strukturelle und funktionelle Charakterisierung von ausgewählten bakteriellen Zelloberflächen-Komponenten, die eine wichtige Rolle bei der Wechselwirkung mit der Umgebung spielen. In Gram-positiven Bakterien vermitteln, an das Peptidoglykan (PG) gebundene, nicht-klassische sekundäre Zellwand-Polymere (SCWP) die Verknüpfung von S-Schicht(glyko)proteinen mit dem PG. Von besonderer Bedeutung sind dabei Pyruvat-Ketale als wichtiger Bestandteil der SCWPs zur vermuteten Anbindung an S-Schichten mit N-terminalen Surface-Layer Homologie (SLH) Domänen (meistens drei Domänen). In Paenibacillus alvei CCM 2051T bestehen SCWPs aus mehreren [-3)-?-D-ManpNAc-(1-4)-?-D-GlcpNAc-(1-] Disaccharid-Wiederholungseinheiten, wobei die ?-ManpNAc Reste mit den Pyruvat-Ketalen modifiziert sind. Die Pyruvat-Modifizierung ist für die Verknüpfung wichtig, aber die molekulare Basis dafür ist unbekannt. In diesem Zusammenhang ist interessant, daß das Enzym Pyruvyltransferase (CsaB) in unmittelbarer Nähe zum Strukturgen für das S-Schichtprotein SpaA am Genom lokalisiert ist. Erste Modellierungen der SLH Region des S-Schichtproteins Sap von Bacillus anthracis wurden kürzlich publiziert und haben die Oberflächenstruktur eines Pseudotrimers gezeigt, an welches das stammspezifische SCWP dieses Bakteriums binden kann. Unsere, leider zeitlich beeinträchtigen, Untersuchungen der 3D-Struktur des SpaA/SCWP Komplexes von Paenibacillus alvei CCM 2051T zielten darauf ab, die molekularen Wechselwirkungen zwischen pyruvylierten SCWPs und den SLH-Domänen des S-Schichtproteins SpaA zu zeigen. Entsprechend unserer Hypothese ermöglichen bestimmte Strukturmerkmale der Pyruvat-Ketale und der Aminozucker des SCWP die Wechselwirkung mit kritischen Aminosäuren in den SLH-Domänen. Obwohl zurzeit die Kristallisations-Experimente noch nicht abgeschlossen sind, erwarten wir die 3D-Strukturaufklärung des SpaA/SCWP Komplexes von Paenibacillus alvei CCM 2051T in naher Zukunft. Bisher gab es keine systematischen Untersuchungen der genauen strukturellen Erfordernisse für die Wechselwirkung zwischen pyruvyliertem SCWP und SLH-Domänen von Proteinen. Das Vorkommen von pyruvylierten SCWPs in verschiedenen Bakterien scheint aber auf eine weitere Verbreitung dieses Cell Surface Display-Mechanismus hinzudeuten. Um unser allgemeines Verständnis der bakteriellen Protein-Glykosylierung für Glycan Engineering-Anwendungen zu erweitern, haben wir in Nebenprojekten auch spezifische Glykosylierungsaspekte von S-Schichtglykoprotein-tragenden Bakterien wie Sulfolobus acidocaldarius oder Tannerella forsythia untersucht.