Überauflösende Mikroskopie für große Präparate

Im vorgeschlagenen Projekt sollen die Möglichkeiten der neuen Superkontinuum Laser für die Visualisierung neuronaler Netzwerke genutzt werden. Diese "Weißlichtlaser" erlauben die Verwendung verschiedener Wellenlängen für die mehrfarbige Fluoreszensanregung. Dies ist von großer Bedeutung für biologische Anwendungen, bei denen oft die Kolokalisation verschiedenfarbiger Fluoreszensmarkierungen notwendig ist. Der vorgeschlagene Ansatz basiert auf einem von uns neuentwickelten Mikroskop (Ultramikroskop), das die Aunahme dreidimensionaler Bildstapel von makroskopischen Objekten mit mikroskopischer Auflösung erlaubt. Die Präparate werden hierfür mit einem chemischen Klärverfahren durchsichtig gemacht bei dem die Fluoreszensmarkierung z.B. von Neuronen erhalten bleibt. Weiterhin sollte mit den Supercontinuum Lasern Bildgebung mit stark erhöhter Auflösung durch Anwendung der Prinzipien der STED Mikroskopie möglich sein. Die STED Mikroskopie erlaubt eine bis zu zehnfach höhere Auflösung als die Konfokalmikroskopie. Da die axiale Auflösung im Ultramikroskop nicht der lateralen Auflösung entspricht würde eine Verbesserung der axialen Auflösung durch den STED Mikroskopieansatz die Ultramikroskopie deutlich verbessern. Hierfür sollen spezielle Optiken entwickelt werden, mit denen über Fluoreszensquenching ein besonders dünnes Lichtblatt erzeugt werden kann. Letzendlich sollte überaufgelöste Bildgebung großer biologischer Objekte wie Mäusegehirnen möglich werden.

Wir haben uns damit beschäftigt, eine 3D Mikroskopie mit besonders hoher Auflösung für große Präparate wie ganze Mäusehirne zu entwickeln. Das ist möglich, wenn man die Gehirne vorher einem besonderen Klärverfahren unterzieht, so daß sie ganz durchsichtig werden. Wenn man sie dann von der Seite mit einem besonders dünnen Laserstrahl, der ein Lichtblatts bildet, durchstrahlt, entstehen dünne optische Schnitte, die man von oben mit einem Mikroskop aufnehmen kann. So erhält man tausende von optischen Schnitten aus denen sich im Computer dann die dreidimensionale Struktur rekonstruieren läßt. Für die Auflösung ist es nun entscheidend, daß die optischen Schnitte möglichst dünn sind. Dafür wollten wir das STED Verfahren auf die Lichtblattmikroskopie anwenden. Mit diesem Verfahren ist prinzipiell eine sehr hohe Auflösung zu erreichen, allerdings werden durch die hohe Lichtintensität fluoreszierend markierte Zellen in der Probe schnell gebleicht. Deshalb haben wir schließlich eine neue Optik zur Lichtblatterzeugung entwickelt, die ohne das STED Verfahren auskommt. Damit konnten wir ganze Mäusehirne mit bislang nicht erreichter dreidimensionaler Auflösung aufnehmen.