Inaktivierung von microRNA Genen bei NSCLC Patienten

MicroRNAs (MiRNAs) sind kurze, nicht-kodierende RNAs die als post-transkriptionelle Regulatoren der Genexpression verschiedene biologische Prozesse beeinflussen. Die Expression von MiRNA Genen kann in Krebszellen dereguliert sein. So wurde in Lungenkarzinomen eine reduzierte Expression bestimmter MiRNA Gene beschrieben, wobei über die Ursachen der reduzierten Expression bisher nur wenig bekannt ist. Kürzlich wurde jedoch berichtet, dass neben anderen Mechanismen auch epigenetische Veränderungen, vor allem die DNA Methylierung (nachfolgend bezeichnet als Methylierung), zur Inaktivierung von MiRNA Genen beitragen können. Wir haben deshalb in Voruntersuchungen die Expression von ~ 800 MiRNA Genen vor und nach Behandlung der nichtkleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC) Zelllinie A549 mit dem DNA Methyltransferase Inhibitor 5-Aza-2`- Deoxycytidin (Aza-dC) oder mit der Kombination aus Aza-dC und dem Histondeacetylase-Inhibitor Trichostatin A analysiert. Dabei konnten wir 41 MiRNA Gene identifizieren, deren Expression nach pharmakologischer Behandlung erhöht war. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Expression verschiedener MiRNA Gene durch epigenetische Mechanismen reguliert wird. Zusätzlich konnten wir mit der methylierungs-spezifischen PCR die häufige Methylierung des MiR-193a Gens in primären NSCLCs nachweisen. Insgesamt zeigen unsere vorläufigen Ergebnisse, dass bestimmte MiRNA Gene in primären NSCLCs methyliert sein können. Da für die in der Voruntersuchung verwendeten Methode zur genomweiten Methylierungsbestimmung proliferierende Zellen notwendig sind, ist diese Methode nur für die Analyse von Zelllinien, jedoch nicht für die Analyse von Gewebeproben geeignet. Eine kürzlich neu beschriebene Methode, die die Immunpräzipitation methylierter DNA mit nachfolgenden Microarray (MeDIP-chip) Analysen kombiniert, erlaubt jedoch eine genomweite Methylierungsanalyse in Gewebeproben. Um mehr Wissen über die Bedeutung der durch Methylierung bedingten Inaktivierung von MiRNA Genen zu erlangen, planen wir genomweit die Methylierung von MiRNA Genen in primären Tumor- und korrespondierenden nicht-malignen Lungengewebsproben von 50 NSCLC Patienten mittels MeDIP-chip Analyse zu untersuchen. Bestimmte MiRNA Gene sollen darüber hinaus in NSCLC Zelllinien und zusätzlichen Tumorproben weiter untersucht werden. Wesentliche Ziele dieses Projektes sind 1. zu untersuchen, ob MiRNA Gene in primären NSCLC Proben tumorspezifisch methyliert sind und ob die Methylierung die Inaktivierung von MiRNA Genen bewirkt, 2. zu bestimmen, ob die tumorspezifische Methylierung bestimmter MiRNA Gene von prognostischer und/oder klinischer Bedeutung für NSCLC Patienten ist und 3. zu untersuchen, ob bestimmte, durch tumorspezifische Methylierung inaktivierte MiRNA Gene, tumorzellwachstums-supprimierende Wirkung haben. Die Ergebnisse dieses Projektes sollen zu einem besseren Verständnis der Bedeutung der durch Methylierung bedingten Inaktivierung von MiRNA Genen in der Pathogenese dieser Tumorerkrankung beitragen und können potentiell zukünftige Behandlungsstrategien von NSCLC Patienten beeinflussen.

Das FWF Projekt P24130 von Frau Ao. Univ. Prof. Dr. Sabine Zöchbauer-Müller wurde 2012 gestartet und hatte eine Laufzeit von 5 Jahren. Ziel dieses Projektes war es, bestimmte Gene zu identifizieren, welche in Tumorproben, nicht aber in normalen Lungengewebeproben von PatientInnen mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC) epigenetisch verändert sind. Der Fokus dieser Studie lag dabei auf der Untersuchung von Genen, die für kurze, nicht-kodierende RNAs, sogenannte microRNAs (miRNAs), kodieren. MiRNAs sind wichtige Regulatoren der post-transkriptionellen Genexpression, die unterschiedliche biologische Prozesse beeinflussen. In Krebszellen kann die Expression von miRNAs dereguliert sein. So wurde in NSCLCs eine verringerte Expression bestimmter miRNA Gene beschrieben, wobei jedoch über deren Ursache(n) bisher nur wenig bekannt war. Ausgangspunkt dieser Studie war unsere Beobachtung, dass neben anderen Mechanismen auch epigenetische Veränderungen, vor allem die DNA Methylierung (nachfolgend bezeichnet als Methylierung), zur Inaktivierung von miRNA kodierenden Genen beitragen können. Um mehr Wissen über die Bedeutung der durch Methylierung bedingten Inaktivierung von miRNA Genen bei NSCLC PatientInnen zu erlangen, haben wir genomweit die Methylierung von miRNA Genen in 50 primären Tumor- und 50 korrespondierenden nicht-malignen Lungengewebeproben mittels Microarray Analysen untersucht. Wir konnten dadurch 34 miRNA kodierende Gene identifizieren, die in den Tumorproben statistisch signifikant stärker methyliert waren als in den Normalgewebeproben. Von der Mehrheit dieser Gene war bisher nicht bekannt, dass sie in NSCLCs methyliert sein können. In weiterer Folge haben wir die Methylierung ausgewählter miRNA kodierender Gene mittels methylierungs-sensitiver Schmelzkurvenanalysen in Gewebeproben von insgesamt 108 NSCLC PatientInnen bestimmt. Auch mit dieser Methode konnten wir die stärkere Methylierung dieser Gene in Tumorproben nachweisen und somit die Daten der Microarray Analysen bestätigen. Ein Vergleich unserer Methylierungsdaten mit klinisch-pathologischen Charakteristika der NSCLC PatientInnen zeigte eine statistisch signifikant stärkere Methylierung von miR-129-2 bei PatientInnen in fortgeschrittenem Krankheitsstadium. Funktionelle Analysen in Zelllinienmodellen haben ergeben, dass das Wachstum von Lungenkarzinomzellen durch die Expression von miR-1179 eingeschränkt werden kann. MiR-1179 ist daher eine potentielle, epigenetisch regulierte, tumor-supprimierende miRNA. Ähnliche Resultate bezüglich Methylierung und tumor-supprimierender Wirkung bei NSCLC PatientInnen haben wir auch bei der Analyse der proteinkodierenden Gene ZNF677 und L1TD1 erhalten. Zusammenfassend tragen unsere Daten dazu bei, die molekularen Mechanismen in der Pathogenese von NSCLCs besser zu verstehen. Unsere Resultate wurden in internationalen wissenschaftlichen Fachzeitschriften publiziert beziehungsweise sind derzeit in Begutachtung.