Identifizierung von physiologischen Zuständen in Hefe mit neuer IR-Technik

Das Ziel dieses Projektes ist die Entwicklung einer neuen in-line fähigen Messmethode zur Detektion und Erkennung von physiolologischen Zuständen in Zellen (Hefe) sowie deren Anwendung in der Bioprozesskontrolle. Eine Ultraschall unterstützte, faseroptische Infrarot (IR)-Messsonde, basierend auf dem Prinzip der abgeschwächte Totalreflexion, soll zunächst verbessert, und dann für die in-line Messung von Hefezellen in Fermentationen angewandt werden. Diese neuartige Methodenkombination ermöglicht IR Spektren selektiv entweder von Zellen (Hefe) oder von in der Fermentationsbrühe gelösten Stoffen (Substrate, Metabolite) aufzunehmen. Durch gezielte Limitationen in der Medienzusammensetzung sollen S. cerevisiae und P. pastoris in definierte statische oder transiente physiologische Zustände gebracht werden. Dies führt zu Unterschieden in den Konzentrationen an Speicherkohlenhydraten (SC: Speicherkohlehydrate) (Glykogen, Trehalose, Mannan, etc.) in der Zelle, welche sehr stark von der Art des Stresses abhängen. Zunächst sollen Proben gezogen werden um von sich in verschiedenen statischen physiologischen Zuständen befindlichen S. cerevisiae Infrarotspektren off-line aufnehmen zu können. Diese Arbeiten werden durch parallel durchgeführte klassische Referenzanalytik ergänzt. Die für SC bzw. für latente Variablen (physiologischer Zustand) charakteristischen Banden sollen mittels chemometrischer Datenanalyse identifiziert werden. Ziel ist es eine Methode zu entwickeln um physiologische Zustände direkt aus den Infrarotspektren der Zellen (Hefe) ablesen zu können und damit die Medienentwicklung und Prozesskontrolle von Bioprozessen effizient zu unterstützen. In der Folge soll die entwickelte Messsonde zur in-line Messung in einem 20L Bioreaktor verwendet werden. Die gleichen statischen physiologischen Zustände wie für die off-line Analyse werden in S. cerevisiae und P. pastoris provoziert, außerdem werden weitere Limitationen und prozessinduzierte Stressfaktoren, wie pH und Temperatur, eingeführt. Die IR Spektren der Zellen bzw. der im Medium gelösten Stoffe werden eine komplette Quantifizierung der Stöchiometrie und des primären Metabolismus ermöglichen. Abschließend werden transiente physiologische Zustände in kontinuierlichen Kulturen durch dynamische Änderungen der extrazellulären Prozessumgebung provoziert. Basierend auf den IR Spektren soll eine Erkennung von physiologischen Veränderungen möglich werden. Am Ende des Projektes wird ein Werkzeug zur Detektion von Veränderung des physiologischen Zustandes entwickelt und charakterisiert worden sein, welches zur Medien- Entwicklung und zur Optimierung von Bioprozessen, sowie zur Prozesskontrolle verwendet werden kann.

Innerhalb dieses Projektes wurden zwei sich ergänzende Technologien zu einem neuen analytischen Messgerät kombiniert, welches nun erstmals in der Lage ist Mikroorganismen in semi-industriellen Fermentationen auf ihre chemische Zusammensetzung hin zu untersuchen. Die eine der beiden Technologien verwendet Ultraschall zur Partikelmanipulation, die andere Technologie vermisst Proben im infraroten Spektralbereich zur chemischen Charakterisierung derselben. Mittels stehender Ultraschallwellen ist es möglich akustische Schallstrahlkräfte auf Partikel in einer Suspension wirken zu lassen. So ist es auch möglich eine Ultraschallfalle zu bilden in welcher Partikel gefangen und so auch angereichert werden können. Durch Veränderung der angewandten Ultraschallfrequenz kann der Ort an dem sich die Partikel anreichern kontrolliert verschoben werden. Eine solche Ultraschallfalle inklusive der dazu notwendigen Mechanik, Elektronik sowie Software wurde entwickelt und mit einem kommerziellen faseroptischen infrarotspektroskopischen in-line Sensor kombiniert. Dieser Sensor beinhaltet ein Sensorelement (Diamantfenster), wobei nur Probe die an diesem eng anliegt vermessen werden kann. Mit Hilfe der entwickelten Ultraschallfalle ist es nun möglich Partikel an dieses Sensorelement anzudrücken und so zu vermessen bzw. es von diesem wegzuhalten, sodass Partikel bewusst nicht, die übrige Fermentationsbrühe jedoch sehr wohl, spektroskopisch erfasst werden können. Durch Wechsel der Ultraschallfrequenz welches ein Andrücken bzw. Weghalten der Partikel zur Folge hat und durch Bildung eines Differenzspektrums können nun erstmals aussagekräftige Spektren der Partikel (Mikroorganismen) während einer laufenden Fermentation erhalten werden. Dieser neue Analysator wurde erfolgreich anhand von Hefefermentationen, welche als Modellsysteme dienten und in einem gerührten semi-industriellen Fermenter durchgeführt wurden, entwickelt und getestet. Die Fermentationsbedingungen wurden so eingestellt, dass wichtige Nährstoffe limitiert und so Stress in den Hefezellen induziert wurde. Dieser Stress hatte einen geänderten Stoffwechsel und so auch eine geänderte chemische Zusammensetzung der Hefezellen zur Folge. Besonders gut gelang es die sich ändernde Zusammensetzung im Bereich der Zucker (Glukose, Trehalose, Glykogen, Mannose) in-line zu verfolgen. Die erhaltenen Ergebnisse konnten auch mit Hilfe einer Referenzanalytik (Hochdruckflüssigkeits-chromatographie) sowie erneut IR Spektroskopie verifiziert werden. Gegen Ende dieses Projektes wurden auch andere biochemische Systeme erfolgreich untersucht sowie die Ultraschallpartikelmanipulationstechnik auch erfolgreich mit anderen in-line Messtechniken wie der Raman Spektroskopie als auch der in-line Mikroskopie kombiniert.