Funktionale Analyse der Letm1 Proteine

Die MDM38/LETM1 Gene kodieren konservierte mitochondrielle Proteine mit einer essentiellen Funktion im Erhalt der mitochondriellen Ionen und Volumen Homeostase durch die Regulierung des transmitochondriellen K + - H+ Austauschsystems. Inaktivierung von Mdm38/LETM1 führt zu gravierenden mitochondriellen Dysfunktionen, die zur Mitophagie und zum Zelltod führen. In Menschen trägt die hemizygote LETM1 Gendeletion zum Wolf- Hirschhorn Syndrom bei. Zugabe des synthetischen K+ -H+ Austauschsystems Nigericin konnte alle durch Inaktivierung von LETM1 verursachten Zelldefekte vollständig aufheben. Allerdings wurde kürzlich eine Rolle von LETM1 im mitochondriellen Ca2+/H+ Austauschsystem vorgeschlagen. Dieses Projekt hat drei Ziele. Erstens soll endgültig an Liposomen mit rekonstituierten LETM1 und Kontrollen, SMPs (sub mitochondrielle Partikeln) und isolierten Mitochondrien geklärt werden, ob LETM1 K+ , Ca2+ oder beides gegen H+ austauscht und ob Ca2+in Abhängigkeit des K+ -H+ Austauschsystems transportiert wird. Zweitens soll hier geklärt werden wie LETM1, ein Protein mit einer einzigen transmembranen Domäne, den Ionenaustausch katalysiert: als Antiporter per se (durch hochmolekuläre Komplexbildung) oder eher als essentieller Co-Faktor des noch unbekannten Antiporters. Diese Fragestellung wird unterstützt durch die proteomische Identifizierung des noch unbekannten Antiporterproteins, das hier unter beinahe physiologischen Bedingungen als LETM1 Interaktionspartner ermittelt wird. Drittens werden durch Mutationsanalysen die relevanten Funktionsbereiche von LETM1 definiert. Für das Verständnis der Phänotyp-Genotyp Korrelation zwischen LETM1 Haploinsuffizienz und Epilepsie im Wolf-Hirschhorn Syndrom erachten wir die Aufklärung der hier gestellten Fragen für bedeutend und wollen diese mittels aller uns und unseren Kollaborationspartnern zur Verfügung stehenden Techniken lösen.

Mitochondrien sind unentbehrliche Organellen die unsere Zellen mit Energie, Metaboliten und Vorläufermolekülen für DNA und Aminosäuren versorgen. Deren Fehlfunktion wird der ganzen Zelle zur Gefahr und verursacht zahlreiche Erkrankungen. In ihrer Hauptfunktion der ATP Gewinnung, speichern Mitochondrien den Großteil der Energie im Membranpotential ab, welches die Kationenaufnahme über Transporter reguliert. Die Abgabe von überschüssigen Kationen wird hingegen von Austauschern übernommen. Diese garantieren eine physiologische Konzentration der Kationen in den Mitochondrien. Funktionieren sie nicht, sammeln sich zu hohe Kationenkonzentration innerhalb der Mitochondrien an die toxische Folgen haben. Die Calciumabgabe zum Beispiel wird über einen unbekannten Ca2+/H+ Austauscher und NCLX, den bereits identifizierten Ca2+/Na+ Austauscher reguliert. Kalium ist das häufigste zelluläre Kation und dessen Balance ist deshalb so wichtig, weil es ein osmotischer Regulator ist. Zuviel Kalium in den Mitochondrien bedeutet geschwollene und funktionsdefekte Mitochondrien. Das bisher einzige identifizierte Protein, das K+ in denMitochondrien durch eine K+/H+ Austauschfunktion (KHE) reguliert, ist LETM1. Diese Funktion ist für den Lebenserhalt der Zelle und den ganzen Organismus lebensnotwendig. Dementsprechend wurde gezeigt, dass Wolf Hirschhorn Syndrom Patienten die LETM1 nur an einem der Chromosomenarmen haben, unter Epilepsie leiden. Vor kurzem wurde LETM1 auch in einem Drosophila Screen als Calcium Austauscher (HCX) gefunden. Seither wird die Funktion von LETM1 heftig diskutiert.Unser Ziel war es die Debatte zu lösen. Zum ersten Mal wurde in diesem Projekt die KHE und HCX Funktionen von LETM1 in humanen Zellen, isolierten Mitochondrien, sowie Liposomen untersucht. Ergebnisse der Untersuchungen zeigten dass LETM1 erforderlich für die KHE Aktivität in Mitochondrien humaner Zellen ist hingegen nicht für die HCX Funktion. Jedoch fanden wir, dass die Aktivität des NCLX indirekt durch LETM1 reduziert war. Wir führen das darauf zurück, dass ohne LETM1 und KHE Funktion, K+, Na+ und der pH in den Mitochondrien steigt, und somit NCLX verlangsamt wird.Des Weiteren untersuchten wir in dieser Studie eine pathogene LETM1 Punktmutation, die an einem jungen Patienten mit schwerer Kardiomyopathie identifiziert wurde. Unsere Ergebnisse wiesen nach, dass diese Punktmutation eine Funktionsverlustmutation war, da das mutierte LETM1 weder das Zellwachstum noch die KHE Funktion wiederherstellen konnte in Zellen welchen LETM1 fehlte.Da LETM1 ein hochmolekulares Proteinkomplex bildet, war ein weiteres Ziel des Projektes die Identifizierung des Interaktionspartners von LETM1. Dazu verwendeten wir einen proteomischen Ansatz. Wir entwarfen eine neue miniaturisierte und vereinfachte Methode um das LETM1-Interaktionsnetzwerk aus isolierten Mitochondrien zu bestimmen. Die Funktionalität unseres neuen Ansatzes überprüften wir anhand des bereiten bekannten Interaktionsnetzwerkes des mitochondriellen Transporters MCU. Unser Ansatz bietet den Vorteil mit geringen Proteinmengen und vereinfachten Mitochondrien-angepassten Schritten eine optimale Zahl an Interessanten Kandidaten zu identifizieren. Durch diesen, fanden wir einen neuen Interaktionspartner von LETM1 der alle Eigenschaften eines mitochondriellen Kationentransporters aufweist: Lokalisierung in der Innenmembran der Mitochondrien, 6 bis8 Transmembranregionen, Mitglied einer konservierten Proteinfamilie die bekannter Weise den intrazellulären Calcium Haushalt reguliert.Insgesamt hat dieses Projekt im Wesentlichen zu einem besseren Verständnis der Funktion von LETM1 beigetragen und ein neues Protein identifiziert, das den Kationenhaushalt in den Mitochondrien mitreguliert.