Chalkon 3-hydroxylase

Dieses Projekt beschäftigt sich mit offenen Fragen der Hydroxylierung von Chalconen. Dies spielt eine wichtige Rolle in der Biosynthese von anthochloren Pigmenten (Chalcone und Aurone), die für die gelbe Blütenfärbung und für die Ausprägung von UV-honey guides in Korbblütler-Arten verantwortlich sind und auch gesundheitsfördernde Wirkungen beim Menschen aufweisen. Zudem stellen Chalcone die unmittelbaren Vorstufen für die Bildung der Flavonoide dar, die wichtige Bestandteile der menschlichen Nahrung sind. Aber auch einige Phytoalexine auf Isoflavonoidbasis werden ausgehend von den Chalconen gebildet. Die kürzlich entdeckte Cytochrom P450 abhängige Chalcone 3-hydroxylase (CH3H) katalysiert die Einführung einer Hydroxylgruppe an der Position 3 von Chalconen. Die Reaktion weist große Ähnlichkeit mit der Hydroxylierung von Flavonoiden an der Position 3` auf, kann jedoch von der bekannten Flavonoid 3`-hydroxylase (F3`H) trotz ihrer breiten Substratspezifität nicht katalysiert werden. Kürzlich wurde von der Antragstellerin aus Blütenblättern von Cosmos sulphureus der erste cDNA-Klon isoliert, der für eine spezifische CH3H codiert. Gemessen an der hohen CH3H Aktivität zeigt das Enzym in vitro nur eine F3`H-Nebenaktivität, was darauf hinweist, dass die CH3H im Lauf der Evolution aus der F3`H entstanden ist. Angesehen von der Substratakzeptanz unterscheidet sich die CH3H von der F3`H noch durch eine ausgeprägte Expression in den Blüten. Das Projekt konzentriert sich daher auf die Entschlüsselung der molekularen Grundlagen für die Chalconspezifität der CH3H, Untersuchungen zur Substratspezifität der CH3H in planta und auf den CH3H Promotor der für die gewebespezifische Expression verantwortlich ist. Unterschiede im Flavonoidmetabolismus transgener Arabidopsislinien sollen über die Wirkung der CH3H unter physiologischen Bedingungen Aufschluss geben. Sequenzvergleiche von CH3H und F3`H aus verschiedenen Pflanzen sollen CH3H typische Sequenzbereiche identifiziert werden und durch gezielte Mutationen Hybridgenen jene Sequenzen identifiziert werden, die für die Chalconspezifität verantwortlich sind. Dies legt den Grundstein für das Verständnis für den Aufbau des aktiven Zentrums von CH3H und F3`H, sowie für die beobachteten Substratspezifitäten und die Reaktionsmechanismen. Der Promotorbereich wird mit Hilfe von chimären ch3h::GUS Konstrukten in transgenen Tabakpflanzen näher untersucht.

Dieses Projekt beschäftigte sich mit der Bildung von Farbstoffen in Pflanzen. Die Ergebnisse wurden in 12 Publikationen (8 angenommen, 1 eingereicht, 3 in Arbeit), 8 Konferenzbeiträge, 3 Diplomarbeiten und 1 Dissertation veröffentlicht und initiierten ein EU-Projekt in dem 6 DoktorandInnen über 4 Jahre Training in modernen Züchtungstechniken im Rahmen des Europäischen Industriellen Doktoratkollegs FlowerPower (675657 FLOWERPOWER-H2020-MSCA-ITN-2015) erhalten werden. Auffällige Färbung ist eine wichtiger Vorteil für die Pflanzen (z.B. Signale, UV-Schutz, Lichtausbeute). Sie spielt aber auch bei Zierpflanzen und pflanzlicher Nahrung eine große Rolle für die Kaufentscheidung des Konsumenten, wobei im Fall der Nahrungsmittel neben optischen Effekten auch gesundheitliche Aspekte eine wichtige Rolle spielen, da rote und gelbe Farbstoffe häufig gesundheitsfördernde Wirkungen aufweisen. Das Projekt konzentrierte sich auf die Chalkon-3-hydroxylase (CH3H), ein Schlüsselenzym im Biosyntheseweg spezieller gelber Farbstoffe, die als anthochlore Pigmente bezeichnet werden. Die CH3H wurde kürzlich in der gelb blühenden Zierpflanze Cosmos sulfureus entdeckt und ist wegen ihrer speziellen Substratspezifität von großem Interesse. Es ist wahrscheinlich, dass sich die CH3H im Lauf der Evolution in Anpassung an Bestäuber, die gelbe Blütenfarbe bevorzugen, aus der gewöhnlichen Flavonoid-3-hydroxylase (F3H), die an der Bildung von den bioaktiven Flavonoiden beteiligt ist, entwickelt hat. Das Projekt isolierte neue CH3H und F3H Gene aus gartenbaulich wichtigen Pflanzen. Es wurden neue Erkenntnisse in Bezug auf die Substratspezifität der von ihnen codierten Enzyme gewonnen. Durch den Vergleich der F3H und CH3H Gene wurden die Abschnitte identifiziert, die für die unterschiedliche Substraterkennung essentiell sind. Durch Veränderung der Gene konnten F3Hs und CH3Hs gezielt ineinander umgewandelt werden. Die Substratspezifität kann allerdings durch kleine Veränderungen im Gen stark beeinflusst werden, so dass für das vollständige Verständnis der erhaltenen Daten eine Kristallstruktur der CH3H oder F3H unerlässlich ist. Als Vorarbeit dazu, wurden im Projekt verschiedene Produktionssysteme für größere Mengen des Proteins getestet. In einem Folgeprojekt soll dieses Wissen nun für die Ermittlung einer CH3H Kristallstruktur eingesetzt werden. Es konnte gezeigt werden, dass viele aber nicht alle- F3Hs und CH3Hs auch Substanzen umwandeln, die sehr spät im Flavonoidbiosyntheseweg gebildet werden. Interessanterweise bedingt das Unvermögen der Erdbeer-F3H diese späten Verbindungen umzusetzen die typische hellrote Erdbeerfarbe. F3H und CH3H können auch seltene Verbindungen im Apfel umsetzen und dadurch die Bildung von 3-Hydroxyphloridzin auslösen. Mittels Modellpflanzen konnte gezeigt werden dass dies bei Äpfeln zu einer erhöhten Krankheitsresistenz führt. Die essentielle Bedeutung der CH3H für die Bildung der gelben Aurone wurde ebenfalls erstmals eindeutig nachgewiesen.