Strukturelle Charakterisierung von Monoglyzeridlipasen

Monoglyzerid-Lipase (MGL) katalysiert die Hydrolyse von Monoglyzerid (MG) zur freien Fettsäure und Glyzerin. Vertreter dieser Enzymfamilie wurden in unterschiedlichen Bereichen des Lebens (z.B. bei Bakterien, Hefen, Tieren) gefunden und die biologische Funktion scheint sehr von der jeweiligen Spezies abhängig zu sein. In Säugetieren katalysiert MGL den letzten Schritt im intra- und extrazellulären Lipidkatabolismus, ist verantwortlich für den Abbau des Endocannabinoids 2-Arachidonoylglyerol und spielt eine Rolle bei der Progression von Krebs. MG und ganz speziell kurzkettige MG sind toxisch für Bakterien, weshalb MGL eine entscheidende Rolle für das Überleben von Bakterien spielt. Trotz jahrzehntelanger Studien an MGL ist noch sehr wenig über die molekulare Basis der Substratspezifität in Hinblick auf die unterschiedliche Kettenlänge bekannt. Interessanterweise sind nur die 3D Strukturen von humaner MGL bekannt, welche alle innerhalb der letzten zwei Jahre publiziert wurden. MGL zeigt dabei eine a/ß Hydrolase Faltung mit einem Deckel, genannt "Cap", in offener und geschlossener Konformation. In unseren Vorarbeiten bestimmten wir die Kristallstruktur von MGL aus Bacillus sp. H257 (mit nur 17 % Sequenzidentität gegenüber der humanen MGL, und sogar nur 13% innerhalb der Cap-Region). Dennoch wurde eine beinahe identische Architektur der Cap-Region zwischen der humanen und bakteriellen MGL gefunden. In dem vorliegenden Forschungsantrag werden wir die Hypothese untersuchen, dass die Architektur dieser Cap- Region innerhalb verschiedener MGLs konserviert ist. Dafür werden wir die 3D Struktur von YJU3p, dem MGL Ortholog in der Hefe bestimmen und auch die Substratspezifität von biochemisch uncharakterisierten Proteinen mit ähnlicher Cap-Architektur untersuchen. Kristallstrukturen von MGL mit und ohne Inhibitoren werden hinsichtlich substratspezifischer Wechselwirkungen analysiert. Die Rolle des Caps wird auch anhand der Struktur von Proteinchimerären mit unterschiedlichen Capsequenzen studiert. Konformationelle Flexibilität der Cap-Region wird mithilfe von röntgenkristallografischen Methoden als auch NMR-Messungen zur Dynamik untersucht. Mit letzteren kann auch auf die Beweglichkeit an jeder einzelnen Aminosäure analysiert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeiten werden unterschiedliche Aspekte der Forschung von MGL wesentlich bereichern, unter anderen Rückschlüsse zur Dynamik des Proteins, Determinanten der Substratspezifität, sowie auf evolutionäre Randbedingungen jenseits von Sequenzkonservierung. Dieses Wissen kann dann in weitere Folge auch auf die Struktur-Funktions-Beziehung von Protein aus anderen Enzymklassen angewendet werden.

Monoglyzeridlipasen sind wichtige Enzyme, welche die Spaltung der Lipidmoleküle Monoglyzerin in ihre Bestandteile einer entsprechenden Fettsäure und einem Glyzerin katalysieren. Durch diese Funktion sind Monoglyzeridlipasen in vielen physiologischen Prozessen in Gesundheit und Krankheit von großer Bedeutung wie z.B. im intrazellulären und extrazellulären Energiestoffwechsel, Auf- und Abbau von Biomembranen, Signal- und Entzündungsprozessen, sowie bei der Entstehung und dem Wachstum von manchen Krebsarten. Lipasen haben in letzter Zeit auch zunehmendes Interesse für neue Therapiemöglichkeiten von bakteriellen Pathogenen geweckt, da ein geordneter Energie- und Fettstoffwechsel unerlässlich für das Überleben und den Infektionsprozess des Pathogen ist. Zusätzlich sind Lipasen und Monoglyzeride wichtige Komponenten bei biotechnologischen Prozessen sowie in der kosmetischen und Lebensmittelindustrie. Um die katalysierte Reaktion und die spezifische Selektion der umgesetzten Substrate zu verstehen und mögliche hemmende Moleküle zu therapeutischen Zwecke auf rationaler Basis zu entwickeln, ist ein detailliertes molekulares Verständnis nötig. Mit diesem Projekt wurden Einblicke in die Struktur-Funktion-Beziehung von Monoglyzeridlipasen aus unterschiedlichen Organismen (Bacillus sp. H-257, Mycobacterium tuberculosis, Bäckerhefe) erzielt und das vorhandene Wissen bezüglich dreidimensionaler Strukturen von Monoglyzeridlipasen von ursprünglich drei Kristallstrukturen um 10 weitere Strukturen mehr als verdreifacht. Wir konnten so die Substratbindung im Detail studieren, flexible Region identifizieren und verschiedene Konformationen des Proteins experimentell verifizieren. Neben vielen Ähnlichkeiten im generellen Aufbau wurde auch eine unerwartete Konservierung der generellen Architektur des sogenannten Deckels zur Substratbindetasche in Monoglyzeridlipasen von Bakterien, Hefe und Menschen festgestellt. Diese strukturelle Ähnlichkeit konnte auch bereits erfolgreich in der Identifizierung von bisher wenig charakterisierten Proteinen als Monoglyzeridlipase verwendet werden. Kleine Unterschiede in den Bindetaschen zwischen Monoglyzeridlipasen aus Menschen und pathogenen Bakterien können in zukünftigen Studien für die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren der pathogenen Spezies genützt werden.