Funktionelle Charakterisierung neuer RYR1 Varianten bezüglich ihrer MH-Pathogenität

Die maligne Hyperthermie stellt einen lebensbedrohlichen Narkosezwischenfall dar, der in geschätzten 80% der Fälle auf Mutationen in einem intrazellulären Ca2+ Freisetzungskanal, dem Ryanodinrezeptor 1 (RYR1) des Skelettmuskels zurückzuführen ist. Es kann dabei während einer Narkose mit bestimmten volatilen Anästhetika (sg. Triggersubstanzen) zu unkontrollierter Ca2+ Freisetzung im Muskelgewebe kommen, was u. a. zu einer Entgleisung der Körpertemperatur führen kann. Um derartige Zwischenfälle zu vermeiden, wird bei Personen, die im Verdacht stehen, Merkmalsträger der MH zu sein, ein in vitro Kontrakturtest durchgeführt, der aber mit der Entnahme von Muskelbündeln ausgesprochen invasiv und auch teuer ist. Als Alternative dazu konnte in den letzen Jahren ein genetischer Test entwickelt werden, der aber auf Grund der Vielzahl von MH verursachenden Mutationen (derzeit sind 30 Mutationen des RYR1 von der European Malignant Hyperthermia Group als kausativ für MH anerkannt) nur bei solchen Personen angewandt werden kann, bei denen die Verdachtsmutation bekannt ist. Wir bieten seit kurzem den genetischen Test an unserer Klinik an und möchten ihn einer möglichst großen Zahl von Personen zu Gute kommen lassen, weshalb es notwendig ist, die zu Grunde liegenden Mutationen zu identifizieren. Bei der Suche nach MH Mutationen haben wir bisher auch drei neue Mutationen entdeckt, die vermutlich kausativ aber nicht in der Liste der approbierten Mutationen enthalten sind und daher vorderhand nicht von diagnostischem Wert sind. Um ihnen einen diagnostischen Wert zuweisen zu können und herauszufinden, ob diese Mutationen für die MH eine Rolle spielen, muss eine eindeutige Genotyp Phänotyp Relation bestehen. Da die von der MH betroffene Population in Österreich aber zu klein dafür ist, muss ein kausativer Zusammenhang experimentell nachgewiesen werden. Dazu wollen wir den RYR1 in Zelllinien exprimieren und die fraglichen Mutationen einführen. Spezifische Aktivatoren des RYR1, wie Koffein oder 4-Chloro-m-Kresol verursachen dann eine Ca2+ Freisetzung in solchen Zellen. Rezeptoren mit einer MH relevanten Mutation zeigen eine gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber diesen Substanzen. Die Schwierigkeit bei der Expression des RYR1 ist neben seine Größe die Tatsache dass er im Muskel nicht isoliert vorkommt sondern mit spezifischen Proteinen, wie dem L-Typ Ca2+ Kanal interagiert. Diese Interaktionen können durchaus die Empfindlichkeit auf Triggersubstanzen erhöhen, weshalb ein spezielles muskuläres Expressionssystem verwendet werden sollte. Dabei handelt es sich um eine Muskelzelllinie von genetisch veränderten Mäusen, denen ein funktioneller RYR1 fehlt. Wir hoffen mit dem Nachweis der Kausalität der neuen Mutationen deutlich mehr Betroffenen den schonenderen und billigeren genetischen Test anbieten zu können.

Das Projekt hatte die Abklärung von mindestens 3 möglichen Mutationen im humanen Ryanodinrezeptor 1 (RYR1) bezüglich ihrer Kausalität für die maligne Hyperthermie (MH) zum Ziel. Der RyR1 ist ein intrazellulärer Ca2+ Kanal, der in Skelettmuskelzellen vorkommt und für die Muskelkontraktion eine entscheidende Rolle spielt. Mutationen in diesem Rezeptor können den Kanal destabilisieren, womit oftmals eine besondere Empfindlichkeit gegenüber halogenierten Kohlenwasserstoffverbindungen entsteht. Solche Verbindungen können beispielsweise Allgemeinanästhetika, wie früher das Halothan oder heute das Sevofluran sein. Bei entsprechend disponierten Personen besteht dann die Gefahr, dass es während einer Narkose mit diesen Mitteln zu unkontrollierter Ca2+ Ausschüttung in Muskelzellen kommt, was bei Nichtbeachten der Symptome (Muskelstarre, Körpertemperaturanstieg,...) bis zum Tod der Betroffenen führen kann. Ziel des Projekts war es, RYR1 Mutationen, die erstmals in österreichischen MH Patienten identifiziert wurden, auf ihre Rolle bei der Entstehung einer MH hin zu untersuchen. Dazu sollte das RYR1 Gen sowohl in seiner Wildtyp-Form als auch mutiert in HEK-293 Zellen exprimiert werden und der Kanal funktionell auf seine Empfindlichkeit gegenüber pharmakologischen Aktivatoren, wie z. B. Koffein, untersucht werden. Der intrazelluläre Ca2+ Anstieg sollte gemessen, und Änderungen durch die Mutationen bestimmt werden. Kommt es zu einer gesteigerten Empfindlichkeit durch die Mutation, kann von einer MH Mutation ausgegangen werden, wodurch diese in den Katalog der ursächlichen MH Mutationen aufgenommen werden kann, was es wiederum erlaubt für die zukünftige Diagnosestellung einen genetischen Test anzuwenden. Die besondere Schwierigkeit dieser Aufgabe besteht in der Größe des RYR1 Gens bzw. seiner kodierenden Sequenz, die über 15.000 Basenpaare ausmacht und nur schwer in Plasmidform handhabbar ist. Es sollten drei Mutationen untersucht werden (1834G>C, 10042C>G und 11953C>T). Zwei davon (11953C>T und 10042C>G) wurden über kürzere Subklone in die kodierende Sequenz des RYR1 eingeführt. Zur Überprüfung der Korrektheit der Sequenz wurden die Konstrukte komplett sequenziert. Das Ergebnis der Sequenzierung ergab sowohl für den Wildtyp als auch für die mutierten Rezeptoren leider immer wieder Rekombinationen, die zu einem Abbruch der Translation etwa in der Mitte des Proteins und damit zu keiner Expression der Klone führte. Obwohl in verschiedenen rekombinationsdefizienten Bakterienstämmen gearbeitet wurde, war die Rekombination der Klone ein immer wiederkehrendes Problem, sodass DNA, die nach der Sequenzierung als intakt angesehen wurde oft schon nach der nächsten Plasmidpräparation keine funktionellen Kanäle im HEK Zell-Expressionssystem mehr erbrachte.Da die RYR1 DNA offensichtlich sehr instabil ist und in HEK Zellen nur mit geringer Effizienz exprimiert wird, würde sich eine andere Methode der Expression anbieten, bei der mit einem künstlichen bakteriellen Chromosom gearbeitet wird (BAC expression vector). Mit einem derartigen Expressionsvektor können DNA Fragment bis zu einer Größe von 350 kb verwendet werden, wobei hohe Stabilität der Expression über lange Zeiträume gewährleistet wäre und die Expressionseffizienz ebenfalls bedeutend über dem in eukariotischen Zellen ansonsten erreichbaren Niveaus liegt. Eine diesbezügliche Kooperation mit dem Institut für Pharmakologie ist in Vorbereitung.