Kopplung von Orai1 Transmembran-Helices reguliert Kalzium-Einstrom

Die Aktivierung des Kalzium Kanals Orai1 ist ein wichtiger Schritt für die Stimulierung des Immunsystems. Eine Gen-Mutation die den Orai1 Kanal geschlossen hält, führt zu einer schweren Immunkrankheit. Unter Einbeziehung von Elektrophysiologie, molekular-biologischen und biochemischen Techniken, sowie Struktur-basierender Mutagenese werde ich versuchen, die regulatorische Funktion der Orai1 Transmembran (TM) Helix Kopplungen für den Kalzium-Einstrom zu entschlüsseln. In Vorexperimenten konnte ich zeigen, daß eine neue Mutation innerhalb der 2. Transmembran Helix, H134A, einen Kalzium-selektiven, STIM1 unabhängigen, konstitutiv aktiven Kalzium-Einstrom bewirkt. Basierend auf der Kristallstruktur von Drosophila melanogaster Orai1, vermuten wir daß dieses Histidine 134 die TM2 sowohl mit TM1 und TM3 über Wasserstoffbrücken-bindungen verbindet und einen geschlossenen Kanal bewirkt. Um diese Hypothese zu überprüfen, werden wir diese Wasserstoffbrückenbindung durch Mutagenese verändern. Zusätzlich, unter Verwendung von Zystein Mutagenese, werden wir Wasserstoffbrückenbindungen durch Disulfid-brücken ersetzen. Diese Technik erlaubt uns Bindungen entweder zu festigen oder aufzubrechen, um eine speicher-abhängige oder konstitutive Aktivierung einzustellen. Weiters werden wir den konstitutiv offenen Orai1-H134A Kanal verwenden, um den Schaltvorgang innerhalb der TM1 Helix zu erforschen. Die Zystein Scanning Technik bestimmt den Grad an Dimerisierung, und ermöglicht es, relative Distanzen im geschlossenen und offenen Kanal zu ermitteln. Alternativ werden wir diese Technik mit einem direkt am Orai1 Kanal gebundenen STIM1 Fragment durchführen. Zusammenfassend sollen diese Experimente erklären, wie die STIM1 Bindung am Orai Kanal dessen TM Helices entkoppelt, zu einer Umlagerung der TM1 führt und den Kanal öffnet.

Kalzium fungiert im menschlichen Körper als essentieller Signalstoff, welcher eine Vielzahl von lebenswichtigen Funktionen reguliert. Kalzium unterstützt die Selbstregulation von Zellen und vermittelt Signale, die für die Aufrechterhaltung und korrekte Funktion des menschlichen Immunsystems unerlässlich sind. Im Immunsystem spielt Kalzium somit bei allergischen Reaktionen, dem Zellwachstum, bei der Bildung von Immunzellen, der Abtötung von infizierten oder krebsartigen Zellen und der Aktivierung von Genen eine wichtige Rolle. Der Kalziumfluss in das Zellinnere von Immunzellen wird durch das Kalzium- Transportprotein Orai1 reguliert. Das aktuelle wissenschaftliche FWF Projekt von PD Dr. Rainer Schindl (MedUni Graz) und Prof. Christoph Romanin (JKU Linz) untersuchte wie das Orai1 eine Pore öffnet um Kalzium in die Zelle zu leiten. Sie konnten dabei Mutationen in das Orai1 Protein einbauen, die den Kanal dauerhaft öffnen und somit Kalzium ungehindert in die Zelle strömen lassen. Dieser Kalzium Einstrom konnte in einzelnen Zellen live gemessen. Mit Hilfe von multi-disziplinären biochemischen und molekularbiologischen Experimenten sowie Molekulardynamik Simulationen gelang es dem Forschungsteam auch den Schaltmechanismus des Orai1 Proteins zu klären. Um den Kalzium Einstrom anzuschalten erweitert sich die Pore und geladene Seitenketten klappen zur Seite. Dieser Kalziumeinstrom schaltet in Folge, molekulare Programme zur Genaktivierung an. Die aktuelle vom FWF geförderte Forschung stellt einen ersten, wichtigen Schritt für die Aufklärung des kalzium-abhängiger Schaltmechanismus von Immunzellen dar.