Regulatorische Aspekte der Phosphatidsäure Biosynthese in Hefe

Phosphatidsäure spielt eine essentielle Rolle im Zellmetabolismus, da diese einerseits das Schlüsselmolekül für die Bildung aller Glycerophospholipide (Membranlipide) und Triacylglycerole (Speicherlipide) darstellt, und weiters auch eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion einnimmt. Aufgrund dieser wichtigen Funktionen der Phosphatidsäure ist es von höchster Bedeutung, dass die in der Zelle vorhandene Menge an Phosphatidsäure an die zellulären Bedürfnisse angepasst ist. In allen eukaryotischen Zellen kommen Enzyme, die an der Bildung von Phosphatidsäure beteiligt sind, in mehrfacher Ausführung vor. Diese so genannten Isoenzyme zeigen unterschiedliche Eigenschaften. Die Mechanismen, die den Beitrag dieser redundanten Enzyme zur Phosphatidsäure Biosynthese regulieren, sind jedoch derzeit noch weitgehend unerforscht. Ziel des hier vorgeschlagenen Projekts ist es die Regulation der Phosphatidsäure Biosynthese zu untersuchen mit dem Fokus auf Glycerin-3-phosphat Acyltransferasen (GPAT), da diese Enzyme den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Phosphatidsäure Biosynthese katalysieren, welcher gleichzeitig die Hauptregulationsstelle darstellt. Für diese Untersuchungen werden wir die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae als experimentelles System einsetzten, ein äußerst wertvoller Modellorganismus, der sich hervorragend zur Untersuchung der Grundprinzipien von Stoffwechselprozessen eignet. In der Hefe gibt es zwei GPAT, Gat1p (Gpt2) und Gat2p (Sct1p), welche beide durch Phosphorylierung modifiziert werden. Bei unseren Untersuchungen werden molekularbiologische, zellbiologische und biochemische Methoden zum Einsatz kommen, um folgende Fragen zu studieren: (i) Gibt es einen Zusammenhang zwischen der Transkriptionsrate und/oder dem Grad der Phosphorylierung der GPAT- Proteine und dem Zellwachstum? (ii) Wirkt sich die Phosphorylierung der GPAT auf die Aktivität, Stabilität und/oder die intrazelluläre Lokalisierung aus? (iii) Wird der Beitrag der GPAT zur Phosphatidsäure Biosynthese durch Interaktionen mit anderen Proteinen beeinflusst? (iv) Werden GPAT-Proteine durch "Feedback" Mechanismen reguliert? Und (v) gibt es einen regulatorischen Grund, dass Gat1p sowohl mit dem Endoplasmatischen Retikulum als auch mit Lipidpartikel assoziiert? Da die Biosynthese von Phosphatidsäure wie viele andere Stoffwechselvorgänge in allen Eukaryoten stark konserviert ist, werden unsere Untersuchungen im Modellorganismus Hefe eine

Phosphatidsäure spielt eine höchst wichtige Rolle im Zellmetabolismus, da diese sowohl für die Bildung aller Glycerophospholipide (Membranlipide) als auch der Triglyceride (Speicherlipide) benötigt wird. Zusätzlich ist Phosphatidsäure an der Signaltransduktion in Zellen beteiligt. Aufgrund dieser wichtigen Funktionen muss die Menge an Phosphatidsäure strikt an die zellulären Bedürfnisse angepasst werden. In diesem Projekt untersuchten wir die Regulation der Biosynthese von Phosphatidsäure an Hand des Modellorganismus Hefe, Saccharomyces cerevisiae. Der erste und geschwindigkeitsbestimmende Reaktionsschritt der Phosphatidsäure Biosynthese wird von einer Glycerin-3-phosphate Acyltransferase katalysiert. Dieses Enzym stellt auch die Hauptregulationsstelle dieses Syntheseweges dar. In Hefe gibt es zwei Glycerin- 3-phosphat Acyltransferasen, Sct1p und Gpt2p. Beide Enzyme sind sogenannte Phosphoproteine, welche durch Phosphatgruppen modifiziert werden. Wir fanden heraus, dass sich ein Defekt in der Phosphorylierung von Gpt2p an einem hochkonservierten Motiv stark auf den Triglyceridmetabolismus auswirkt. Dieses Motiv umfasst drei Phosphorylierungsstellen. Kommt es zu einem Phosphorylierungsdefekt an einer oder mehreren dieser drei Stellen führt dies zu einer deutlichen Erhöhung der Enzymaktivität von Gpt2p und in der Folge zur Anhäufung von Triglyceriden. Die Menge an Glycerophospholipiden der Zelle bleibt jedoch unverändert. Bei ausreichendem Nährstoffangebot werden zwar sowohl in normalen Zellen als auch in Mutantenzellen, welche das phosphorylierungsdefiziente Gpt2p exprimieren, Triglyceride gebildet und gespeichert, doch ist aufgrund der höheren Aktivität des mutierten Gpt2p die Triglyceridbildung in Mutantenzellen deutlich verstärkt. In der Phase des Triglyceridabbaus kommt es jedoch zu einem eklatanten Unterschied zwischen diesen Zellen. Während in normalen Zellen mit Einsetzen der Triglyceridmobilisierung die Gpt2p-Aktivität durch Phosphorylierung reduziert wird, ist dies in Mutantenzellen durch die Phosphorylierungsdefizienz von Gpt2p nicht möglich. Die Aktivität des mutierten Gpt2p bleibt erhöht und Triglyceride werden weiterhin gebildet. Dieser Effekt verhindert somit einen effizienten Triglyceridabbau in den Mutantenzellen und verstärkt zusätzlich den Unterschied im Triglyceridgehalt zwischen normalen und mutierten Zellen. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass sich eine Veränderung des Phosphorylierungsgrades von Gpt2p an diesem konservierten Motiv auch auf die Fettsäurezusammensetzung der Zelle auswirkt. Untersuchungen der physiologischen Bedeutung der Phosphorylierung von Gpt2p an weiteren Phosphorylierungsstellen zeigten, dass die Proteinstabilität dieses Enzyms ebenfalls über Phosphorylierung reguliert ist. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Phosphorylierung der Glycerin-3-phosphate Acyltransferase Gpt2p eine äußerst wichtige Rolle bei der Regulation der Phosphatidsäure Biosynthese spielt, und sich Veränderungen im Phosphorylierungsgrad von Gpt2p sowohl auf Proteinebene als auch auf zellulärer Ebene auswirken.