Hypoallergene Derivate für sichere Immuntherapie von Insektengiftallergie

Hypoallergene Derivate für eine sichere Immuntherapie von Insektengiftallergien Die schwerste und häufig lebensbedrohliche allergische Reaktion vom Soforttyp ist der anaphylaktische Schock, der häufig durch Bienen- und Wespengiftallergene ausgelöst wird. Ungefähr 1.2 3.5% der Bevölkerung leidet an systemischen Reaktionen nach Insektenstichen, und etwa 200 Todesfälle infolge systemischer Stichreaktionen werden in Europa jährlich erfasst. Die einzige kausale und vorbeugende Behandlung von Bienen- und Wespengiftallergien ist die Allergen-spezifische Immuntherapie. Dabei werden dem Patienten Bienen- oder Wespenallergene in ansteigender Dosis subkutan verabreicht. Für die Therapie werden Insektengiftextrakte verwendet, die ein Gemisch aus einer Vielzahl unterschiedlicher Moleküle und Proteine in wenig definierter Menge und Zusammensetzung darstellen. Ziel dieses Projekts ist die Herstellung hypoallergener Proteinvarianten aus Bienen- und Wespengift- allergenen, die als Impfstoff mit deutlich reduzierten Nebenwirkungen für eine spezifische sichere Immuntherapie verwendet werden können. Wichtige Voraussetzung dafür ist die Charakterisierung der IgE-bindenden Epitope von Bienen- und Wespengiftallergenen. Vor allem die Beteiligung von linearen und/oder sequentiellen Protein- oder Zucker-Epitopen an anaphylaktischen Reaktionen soll geklärt werden. Die Allergene werden in Insektenzellen als glykosylierte und nicht-glykosylierte Varianten exprimiert und anschließend mit affinitätschromatographischen Methoden gereinigt. Als Referenzproteine werden die natürlichen Allergene aus den entsprechenden Insektengiften mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Alle Allergenvarianten werden immunologisch hinsichtlich ihrer IgE Reaktivität mit Seren von Bienen und Wespengiftallergikern und biochemisch und biophysikalisch hinsichtlich ihrer Struktur untersucht. Durch den Vergleich glykosylierter und nicht- glykosylierter Proteine kann der Einfluss des Zuckeranteils auf die Struktur und Stabilität der Allergene geklärt werden. Weiters kann die kontrovers diskutierte Beteiligung der gegen Glykane gerichteten IgE-Antikörper an allergischen Reaktionen und deren klinische Relevanz gut untersucht werden. Die allergene Aktivität wird mittels zellulärer in vitro Testverfahren, wie Basophilen- Aktivierungstest getestet. Um hypoallergene Allergenderivative zu generieren, werden die Allergene in der Struktur verändert, so dass sie ihre allergenen Eigenschaften verlieren und IgE- und T- Zellepitope reduziert sind. Das soll durch die Peptid-Carrier Technologie erreicht werden. Dafür werden Peptide, die Teile der allergie-auslösenden IgE-Epitope umfassen, mit einem immunogenen Trägerprotein, das für die notwendige T-Zellhilfe sorgt und selbst kein Allergen darstellt, verbunden und als Fusionsprotein exprimiert. Die vom Allergen stammenden Peptide werden nicht mehr von Patienten IgE Antikörpern erkannt, können aber bei einer Immuntherapie eine schützende IgG- Immunantwort induzieren und führen zu reduzierten Spättyp-Reaktionen, da die allergen-spezifischen T-Zellepitope reduziert wurden. Basierend auf dieser Technologie können für Impfstoffe die wesentlichen allergie-auslösenden Moleküle verändert und als Impfstoffe für sichere und effektive Immuntherapie formuliert werden.

Charakterisierung der anaphylaktischen Epitope von Bienen- und Wespengiftallergenen und die Herstellung hypoallergener Derivate für eine sichere Immuntherapie Die schwerste und auch lebensbedrohliche allergische Reaktion vom Soforttyp ist der anaphylaktische Schock, der im Erwachsenenalter am häufigsten und bei Kindern nach den Nahrungsmitteln am zweithäufigsten, durch Bienen- und Wespengiftallergene ausgelöst wird. Die einzige kausale und vorbeugende Behandlung von Bienen- und Wespengiftallergien ist die spezifische Immuntherapie. Dabei werden dem Patienten Bienen- oder Wespengift in ansteigender Dosis subkutan verabreicht. Es werden dabei Extrakte verwendet, die ein Gemisch aus einer Vielzahl unterschiedlicher Moleküle und Proteine in wenig definierter Menge und Zusammensetzung darstellen. Um einen genau definierten Impfstoff mit deutlich reduzierten Nebenwirkungen für eine sichere Immuntherapie herzustellen, ist es Voraussetzung die allergie-auslösenden Komponenten zu identifizieren und zu charakterisieren. Mit Hilfe molekularbiologischer Methoden können Bienen- und Wespengiftallergene in gereinigter Form hergestellt werden. Die, für die Bienengiftallergie relevanten Allergene sind glykosylierte Proteine und weisen Zuckerketten auf, die als Kohlehydrat-Determinanten bekannt sind und auch in der Pflanzenwelt vorkommen. Sie führen in serologischen IgE Tests zu unerwünschten Kreuzreaktionen. Im Rahmen des FWF-Projektes wurden nicht-glykosylierten Allergenvarianten aus dem Bienengift Api m 1 und Api m 10, sowie die Wespengiftallergene Ves v 1 und Ves v 5 rekombinant hergestellt und charakterisiert. Sie ermöglichen die Bestimmung der allergen-spezifischen IgE-Antikörper im Serum und erlauben die Identifikation des auslösenden Insekts in Bienen-und/oder Wespengiftallergikern. Die Menge der allergen-spezifischen IgE-Antikörper im Blut korreliert jedoch nicht mit dem klinischen Bild der Stickreaktion. Auch in serologischen Tests gemessene niedrige IgE-Spiegel gegen die Markerallergene Api m 1 (Biene) und Ves v 5 (Wespe) können schwere Stichreaktionen auslösen. Der Vergleich von natürlichem glykosyliertem Api m 1 mit nicht-glykosyliertem Api m 1 zeigte, dass der Zuckeranteil keinen Einfluss auf die Struktur, Stabilität und enzymatische Aktivität des Proteins ausübt. Nicht-glykosyliertes Api m 1 zeigt allergene Aktivität in in vitro Testverfahren und enthält anaphylaktische Epitope, die unabhängig von der Zuckerkomponente sind. Die von Api m 1 und Ves v 5- hergestellten linearen Peptide zeigten keine IgE-Reaktivität und dienen als Basis für die Herstellung von hypoallergenen Allergenderivativen. Im Zuge des Projekts gelang es auch einen Kohlenhydratmarker herzustellen, der das Problem der falsch positiven serologischen IgE-Tests aufgrund von Kreuzreaktivität zwischen identischen Zuckerkomponenten in verschiedenen Allergenquellen lösen kann. Dabei wurde die Sequenz eines nicht-allergenen Trägerproteins gentechnisch so verändert, dass sie zwei Glykosylierungsstellen enthält. Das in Insektenzellen hergestellte und gereinigte glykosylierte Protein bindet IgE ausschließlich an den Zucker-Epitopen. Mittels Inhibitionsexperimenten konnten kreuzreagierende Zucker-Epitope nicht nur in Insektengiften und Pflanzen sondern auch in Milben festgestellt werden. Die Zugabe des glykoslierten Proteins zum Serum ermöglicht im Inhibitionstest die Unterscheidung von peptid-spezifischen und kohlenhydrate-spezifischem IgE und verhindert dadurch ungewollte Kreuzreaktivität in serologischen Allergietests.