Charakterisierung von Vibrio cholerae Biofilmen

Die schwere Durchfallerkrankung Cholera wird durch das fakultativ human-pathogene Bakterium Vibrio cholerae verursacht. Der Lebenszyklus von klinisch relevanten V. cholerae Isolaten ist vom ständigen Wechsel zwischen zwei sehr unterschiedlichen Lebensweisen geprägt: Als natürlicher Bewohner der aquatischen Umwelt und als Krankheitserreger im menschlichen Gastrointestinaltrakt.Ein entscheidender Faktor für das Überleben in der Umwelt ist die Biofilmbildung. Neueste Studien lassen vermuten, dass Biofilme auch einen effizienten Weg darstellen, um hohe Keimzahlen auf den nächsten Wirt zu übertragen. Daher tragen Biofilme von V. cholerae ebenso zur Verbreitung der Krankheit Cholera bei. Unter Verwendung eines Reportergen-Systems haben wir während der vorangegangenen Förderperiode erfolgreich Gene identifiziert, welche während der Biofilmbildung von V. cholerae induziert werden. Im Rahmen dieses Projektantrages sollen nun die zwei interessantesten Kaskaden näher untersucht werden. Dazu zählt zum einen die metabolische Verwertung von extrazellulärer DNA (eDNA) als wichtige Matrixkomponente im Biofilm und abundante Nahrungsquelle entlang des Lebenszyklus von V. cholerae. Dabei konnten wir bislang aufzeigen, dass durch die Aktivität der zwei extrazellulären Nukleasen von V. cholerae eDNA zu Nukleotiden abgebaut und somit als Nahrungsquelle genutzt werden kann. Der vorliegende Antrag soll sich nun mit der in weiterer Folge notwendigen Dephosphorylierung der Nukleotide zu Nukleosiden, sowie dem Transport der Nukleoside in die Zelle beschäftigen.Erste Ergebnisse unseres Labors deuten darauf hin, dass V. cholerae 3 Nukleosidtransporter mit unterschiedlicher Nukleobasenspezifität besitzt. Im Gegensatz zu anderen bakteriellen Nukleosidtransportern sind diese Na+-abhängig und ähneln daher eher den humanen Vertretern, welche wichtige Ziele für Chemotherapeutika sind. Weiterhin wollen wir die transkriptionelle Regulation der beteiligten Enzyme und die physiologische Relevanz der Verstoffwechslung von eDNA entlang des Lebenszyklus untersuchen. Zum anderen identifizierte unser Labor zwei O-Glykosyltransferasen (O-OTasen), welche spezifisch im Biofilm induziert sind. Dies deutet auf eine bislang unbekannte O-Glykosylierung von Proteinen bei V. cholerae hindeutet. In der Tat führt die Mutation der O-OTasen zu einer veränderten Biofilmbildung und Morphologie. Vorläufige Daten aus unserem Labor lassen vermuten, dass insbesondere die extrazellulären Proteine der Biofilmmatrix wichtige Ziele der O-OTasen sind. Ziel der zweiten Aktivität im Antrag ist die Erforschung der genauen Interaktionspartner, des transferierten Glycans, sowie die Regulation der O-OTasen. Weiterhin soll die Rolle der O-Glykosylierung für Fitness von V. cholerae in der Umwelt und in vivo charakterisiert werden. Die Ergebnisse dieser Studie werden das Verständnis der Physiologie und Biofilmbildung von V. cholerae und eventuell auch anderer Bakterien verbessern. Idealerweise wird dies die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze beschleunigen, die auf die Persistenz und übertragbaren Formen von pathogenenBakterienwie V. cholerae abzielen. Zudemkönnendie Resultate der Nukleosidtransporter bei der Entwicklung neuer Chemotherapeutika eingesetzt werden.

Die schwere Durchfallerkrankung Cholera wird durch das fakultativ human-pathogene Bakterium Vibrio cholerae verursacht. Der Lebenszyklus von klinisch relevanten V. cholerae Isolaten ist vom ständigen Wechsel zwischen zwei sehr unterschiedlichen Lebensweisen geprägt: Als natürlicher Bewohner der aquatischen Umwelt und als Krankheitserreger im menschlichen Gastrointestinaltrakt. Ein entscheidender Faktor für das Überleben in der Umwelt ist die Biofilmbildung. Neueste Studien lassen vermuten, dass Biofilme auch einen effizienten Weg darstellen, um hohe Keimzahlen auf den nächsten Wirt zu übertragen. Daher tragen Biofilme von V. cholerae ebenso zur Verbreitung der Krankheit Cholera bei. Unter Verwendung eines Reportergen-Systems haben wir während der vorangegangenen Förderperiode erfolgreich Gene identifiziert, welche während der Biofilmbildung von V. cholerae induziert werden. Im Rahmen dieses Folgeprojektes wurden nun zwei Kaskaden näher untersucht. Dazu zählt zum einen die metabolische Verwertung von extrazellulärer DNA (eDNA) als wichtige Matrixkomponente im Biofilm und abundante Nahrungsquelle entlang des Lebenszyklus von V. cholerae. Zum anderen identifizierte unser Labor zwei O-Glykosyltransferasen (O-OTasen), welche spezifisch im Biofilm induziert sind. In silico-Analysen identifizierten mehrere periplasmatische Kandidaten für die Dephosphorylierung von Nukleotiden zu Nukleosiden, aber experimentelle Beweise fehlten. Basierend auf bioinformatischen Daten haben wir drei ORFs identifiziert, die für Nukleosidtransporter kodieren und bestätigt, dass alle drei funktionsfähig sind. Darüber hinaus haben wir ihre Regulation, Kinetik und Spezifität charakterisiert. Aktivität 1 des Forschungsvorhabens charakterisierte nicht nur umfassend die Nukleotidnutzung in V. cholerae, sondern auch deren Einfluss auf die V. cholerae-Fitness in verschiedenen Phasen des Lebenszyklus. Weiterhin identifizierten wir zwei mutmaßliche O-Oligosaccharyltransferasen (O-OTasen) von V. cholerae, die im Biofilm induziert sind. Wir konnten zeigen, dass die O-Glykosylierung einen Einfluss auf die Biofilmbildung in V. cholerae durch Interferenz mit sezernierten Typ-2-Effektoren hat. Da die O-Glykosylierung in Bakterien ein relativ neues Forschungsgebiet ist, haben wir die physiologische Rolle der O-Glykosylierung für V. cholerae näher untersucht und konnten einen globalen Beitrag zur Sekretion von Typ-2-Effektoren, u.a. des Choleratoxins, aufdecken.