Dynamik molekularer Interaktionen in lebenden Zellen

Molekulare Wechselwirkungen, wie etwa Bindungsreaktionen zwischen Proteinen, gehören zu den wesentlichsten Regulationsmechanismen biologischer Prozesse. Die meisten dieser grundlegenden Interaktionen wurden über verschiedene Screening-Verfahren entdeckt und dann in vitro, also außerhalb intakter Zellen, genauer charakterisiert, um biophysikalische Parameter wie Affinität, Bindungs- oder Dissoziationsgeschwindigkeiten zu bestimmen. Wir sind der Meinung, dass diese Interaktionsparameter nicht den Verhältnissen in lebenden Zellen entsprechen, wo ein komplexes Milieu dicht-gepackter Biomoleküle vorhanden ist. Wir glauben, dass wesentliche biologische Prozesse durch Veränderungen von Affinitäten und Interaktionen reguliert werden und dass diese dynamischen Wechselwirkungen in intakten, lebenden Zellen gemessen werden sollten, um sie genauer zu verstehen. Wir haben eine Methode entwickelt, die es uns erlaubt die Dynamik von Protein-Interaktionen in lebenden Zellen durch eine Kombination zweier etablierter Laser-Mikroskop-Techniken zu messen und damit auch die Halbwertszeit von Proteinkomplexen zu bestimmen. Diese Methodik wollen wir im vorgeschlagenen Projekt weiter entwickeln und für physiologische Protein-Konzentrationen anwenden, um die Interaktionen eines biologischen Schlüssel- Prozesses näher zu charakterisieren: dem Entzündungssignalweg der zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kappa B führt. Dazu wollen wir eine neue Technologie einsetzen, die es erlaubt gezielte Veränderungen im Genom einer Zelle vorzunehmen. Durch dieses Verfahren können fluoreszierende Proteine als Marker an die zu untersuchenden Proteine gekoppelt werden ohne ihr Expressionsniveau zu verändern. In der Folge kann unsere neue Mikroskop- Technik auf endogene Proteine in ihrem physiologischen Kontext angewendet werden. Damit wollen wir untersuchen, ob und in welchem Ausmaß sich die molekularen Wechselwirkungen oder auch die Zusammensetzung von Protein-Komplexen im Verlauf der Signal-Übertragung verändern. Darüber hinaus wollen wir feststellen, ob sich die Interaktionsparameter in unterschiedlichen Kompartimenten der Zellen, wie z.B. dem Zellkern im Vergleich zum Zytosol, unterscheiden. Schlussendlich soll damit auch aufgeklärt werden, wie kompetitive Wechselwirkungen von Signalmolekülen der Entzündung in lebenden Zellen ablaufen, wodurch auch neue Angriffsmöglichkeiten für modulierende Substanzen identifiziert werden könnten.

Physiologische Prozesse werden häufig durch makromolekulare Interaktionen reguliert, vor allem solche zwischen Proteinen mit einer Signalfunktion. Diese Wechselwirkungen sind für das natürliche Milieu lebender Zellen aber kaum oder nur sehr schwer messbar - und wurden in den meisten Fällen durch klassische biochemische Methoden in Reaktionsgefäßen (in vitro) untersucht. Unsere Hypothese war, dass in lebenden Zellen kleinere Änderungen in den Bindungsaffinitäten, wie auch die molekulare Dynamik der Wechselwirkungen dazu führen können, dass ein Signalmolekül von einem Bindungspartner zu einem anderen wechselt. Um das untersuchen zu können, etablierten wir neue Methoden, die vor allem ein quantenphysikalisches Phänomen ausnutzen, nämlich den Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) - ein Energie-Übertragungsphänomen, das mit Hilfe von Mikroskopie oder Zytometrie gemessen werden kann. Während unser Projekt darauf abzielte die molekularen Interaktionen des sogenannten NF-B Signalwegs zu untersuchen, einer zentralen Signal-Kaskade bei Entzündungsprozessen, war das Hauptziel unserer Studie neue Mess- und Analyse-Verfahren für molekulare Interaktionen in lebenden Zellen zu etablieren. Der berühmte Ausspruch Galileo Galileis: "Alles messen was messbar ist und messbar machen was nicht messbar ist" war sozusagen das Leitmotiv unseres Projekts. Als Startpunkt zur Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen wählten wir die Kolokalisations-Mikroskopie, ein häufig genutztes Verfahren, um potentielle Interaktionen sichtbar zu machen. Dabei konnten wir beobachten, dass die klassischen Methoden falsch-positive Ergebnisse liefern können und entwickelten eine alternative Technik, bei der eine statistische Pixel-Intensitätskorrelation mit einer Objekt-Erkennung kombiniert wird, was zu deutlich verlässlicheren Resultaten führte. Außerdem konnten wir feststellen, dass eine Kolokalisation noch nicht bedeutet, dass zwei Protein-Arten miteinander interagieren, und somit eine Bindung vortäuschen kann, während der oben erwähnte FRET-Effekt bei korrekter Messung nur bei tatsächlichen Bindungsprozessen auftritt. Als nächstes entwickelten wir eine verbesserte FRET-Messmethode, die nicht nur eine qualitative Aussage über eine Interaktion macht, sondern auch quantitative Messungen von Bindungsparametern erlaubt. Durch einen mathematischen Algorithmus in Kombination mit größeren Datensätzen, mittels Mikroskopie oder Durchfluss-Zytometrie gemessen, waren wir in der Lage auch Parameter wie relative Affinität oder Bindungsverhältnisse zu bestimmen. Auf Basis dieser Methode konnten wir die Interaktion zwischen IKK1 und IKK2 in lebenden Zellen messen und feststellen, dass diese kurz nach Aktivierung des NF-B Signalwegs abnimmt. Das scheint eine Voraussetzung dafür zu sein, dass IKK-Moleküle auch mit anderen Bindungspartnern interagieren können und damit eine dynamische Regulation von Phosphorylierungsreaktionen bei Entzündungsprozessen erlauben. Zusätzlich untersuchten wir auch die Wechselwirkungen zwischen dem Onkogen c-Myc, IKK1 und dem Blutgerinnungsfaktor F3, was tiefere Einblicke in die Zusammenhänge zwischen Krebs, Entzündung und Thrombose ermöglichte. Zusammengefasst kann man feststellen, dass unser Projekt wesentliche wissenschaftliche Fortschritte erzielen konnte, da dabei neue Methoden entwickelt wurden, um Protein-Interaktionen in ihrem physiologischen Umfeld in lebenden Zellen quantitativ zu messen. Außerdem konnten wichtige Parameter der Interaktionen zwischen Molekülen des NF-B Signalwegs bestimmt werden, sowie auch funktionelle Verbindungen zwischen Onkogenen, inflammatorischen Molekülen und Gerinnungsfaktoren.