Palmitoylierung in der frühen T-Zell Signaltransduktion

Die Aktivierung von T-Lymphozyten beruht auf der molekularen Erkennung von Peptid-MHC-Komplexen (pMHC) auf einer antigenpräsentierenden Zelle durch den T-Zell-Rezeptor (TCR). Durch die Bindung des TCR an pMHC verändern die Komponenten der T-Zell-Aktivierungsmaschinerie an der Zellmembran ihre räumliche Anordnung und es kommt zur Phosphorylierung mehrerer Tyrosine an TCR-assoziiertem CD3 durch die Kinase Lck. Diese anfänglichen Phosphorylierungen haben zur Folge, dass zunächst weitere Signaltransduktionsproteine binden können, was schlussendlich zur Aktivierung der T-Zelle führt. Lck ist folglich absolut essentiell für das Zustandekommen einer T-Zell-Antwort. Wenngleich die Abfolge der molekularen Prozesse, die zur T-Zell-Aktivierung führen, weitreichend untersucht worden ist, fehlt bis heute immer noch ein detailliertes mechanistisches Verständnis dafür, wie die räumliche Anordnung der verschiedenen Signaltransduktionskomponenten deren Funktion steuert. Lck besitzt einen N-terminalen Membrananker, der es an die Zellmembran bindet und dadurch notwendig für seine Funktion ist. Der Membrananker besteht aus drei Lipidmodifikationen: einer irreversibel gebundenen Myristinsäure- und zwei reversibel gebundenen Palmitinsäureketten. Die Modifikation durch drei Lipide erscheint interessant, da im Prinzip die Myristinsäure in Kombination mit einer einzigen Palmitinsäurekette ausreichen würde, um Lck fest in der Membran zu verankern. Des Weiteren sollten Wechselwirkungen zwischen Lck und den Corezeptoren CD4 und CD8, die beide Transmembranproteine sind, die Acylierung von Lck obsolet machen. Interessanterweise sind CD4 und CD8 sowie andere Moleküle, die die Aktivität von Lck modulieren, ebenfalls palmitoyliert. Einige von ihnen, wie CD4 und CD8, sind Transmembranproteine, in welchen die Funktion der Palmitoylierung nicht offensichtlich ist. Gleichzeitig haben Studien, die sich mit der Palmitoylierung von CD4 und CD8 beschäftigt haben, widersprüchliche Ergebnisse geliefert. Im gegenwärtige Projekt soll ein fundamentales Verständnis darüber gewonnen werden, wie die Palmitoylierung von Signaltransduktionsmolekülen in der T-Zell-Aktivierung deren räumliche Anordnung und Funktionalität moduliert. In der Vergangenheit wurde Palmitoylierung von Proteinen hauptsächlich mit biochemischen Methoden oder klassischer beugungsbegrenzter Lichtmikroskopie untersucht. Im vorliegenden Projekt wird Einzelmolekülmikroskopie in einem murinen primären T-Zell Modellsystem angewendet, um die noch unerforschten molekularen Mechanismen zu klären,durch die die Palmitoylierung von Signaltransduktionskomponenten die T-Zell-Aktivierung reguliert.

Im Laufe einer Infektion erkennen T-Zellen fremdartiges Antigen und reagieren darauf mit einer spezifische Immunantwort, um potentiell schädliche Eindringlinge zu beseitigen. Dieser Erkennungsprozess wird durch die räumliche Organisation der T-Zellmembran beeinflusst. Ziel des vorliegenden Projekts war es zu erforschen, wie die Organisation von bestimmten Membranproteinen von T-Zellen in sogenannten Nanoclustern, d.h. Anhäufungen von Proteinen auf kleinstem Raum (innerhalb weniger nm), reguliert ist und wie diese die Funktionsweise von T-Zellen regulieren. Um Nanocluster zu detektieren und zu charakterisieren, entschieden wir uns für die Verwendung von Einzelmolekül-Lokalisierungs-Mikroskopie (SMLM, aus dem Engl.: single molecule localization microscopy), die es erlaubt zelluläre Strukturen in der Größe von ~20 nm oder weniger Radius optisch aufzulösen. Diese Technik kann jedoch auch durch Artefakte beeinträchtigt werden, die die quantitative Interpretation der Bilddaten beeinträchtigen können, insbesondere in Bezug auf Rückschlüsse auf die lokale räumliche Verteilung von Molekülen, wie zum Beispiel Nanoclustern. Obwohl diese Problematik schon seit Längerem bekannt war, gab es keine idealen Strategien zur Korrektur. Während das ursprüngliche Ziel des vorliegenden Projekts in der Charakterisierung von Nanoclustern in T-Zellen bestand, zeigten die ersten Versuche, dass publizierte Daten aus der Literatur, die die Basis für das Projekt bildeten, möglicherweise die Tragweite der unterschiedlichen Artefaktquellen unterschätzt hatten. Aus diesem Grund änderten wir den Fokus des Projekts und entwickelten eine neuartige experimentelle Strategie, um Nanocluster in SMLM Bildern zu detektieren. Im Weiteren verwendeten wir in weiterer Folge die von uns entwickelte Methode, um wichtige T-Zellproteine zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigten letztendlich, dass Nanocluster weit weniger häufig vorkommen als ursprünglich angenommen. Aus diesem Grund legt unsere Arbeit den Grundstein dafür, die derzeitigen Modelle zur Aktivierung von T-Zellen und des adaptiven Immunsystems zu revidieren.