AGMO: Einfluss auf die Adipozytendifferenzierung

Tetrahydrobiopterin ist ein Vitamin-ähnlicher Kofaktor, der für die Reaktionen, welche von den aromatischen Aminosäurehydroxylasen und den Stickstoffmonoxidsynthase katalysiert werden, essentiell ist. Wir haben kürzlich Alkylglycerol Monooxygenase beschrieben, das fünfte Enzym, welches diesen Kofaktor braucht und konnten zeigen, dass Tetrahydrobiopterin und Alkylglycerol Monooxygenase neue und unerwartete Änderungen im Lipidstoffwechsel und in der zellulären Signaltransduktion bewirken. Dieses Projekt wird nun zum ersten Mal der Frage nachgehen, welche Rolle die Alkylglycerol Monooxygenase in der Signalweiterleitung und in der Zelldifferenzierung hat. Hier weisen neue Erkenntnisse der Fettzellreifung darauf hin, dass diesem Enzym eine zentrale Rolle zukommt. Die Antragstellerin verfolgt deshalb das Ziel, eine Brücke von Zelllinien zu primären Zellen zu spannen und mittels etablierter Methoden kombiniert mit bahnbrechenden hochauflösenden Lipidanalysen und einem absolut einzigartigen Mausmodell für Alkylglycerol Monooxygenase den Einfluss dieses Enzyms zu beschreiben. Eine Schlüsselrolle von Alkylglycerol Monooxygenase im Lipidstoffwechsel würde dieses Enzym zu einem neuen Angriffspunkt in der Bekämpfung von Fettsucht und Typ 2 Diabetes machen, zwei der aktuell bedrohlichsten Gesundheitsprobleme unserer Welt. AGMO IN ADIPOCYTE DIFFERENTIATION KATRIN WATSCHINGER1

Alkylglycerol Monooxygenase (AGMO) ist ein sehr hydrophobes Membranprotein, welches im letzten Abschnitt des Etherlipidabbaus für die Spaltung von Alkylglycerolen verantwortlich ist. Die genetische Information von AGMO wurde erst im Jahr 2010 beschrieben. Seither untersuchen wir die biochemischen Eigenschaften und die physiologische Funktion dieses Enzyms. In diesem Projekt haben wir die Rolle von AGMO in der Adipozytenreifung von 3T3-L1 Zellen untersucht. Ebenso haben wir eine Methode etabliert, mit der die von uns hergestellte AGMO Knockoutmaus genotypisiert werden kann und eine erste Phänotypisierung dieser Tiere durchgeführt. Wir konnten erfolgreich zeigen, dass AGMO in 3T3-L1 Fibroblasten exprimiert und aktiv ist und dass die Enzymaktivität während der Umwandlung in reife Fettzellen zunimmt. Eine Herunterregulation von AGMO hatte keinen Einfluss auf das Vermögen der Zellen, reife Fettzellen und Fetttröpfchen zu bilden. Mittels Lipidomics verglichen wir Zellen mit und ohne Herunterregulation von AGMO sowie vor und nach der Fettzellreifung. Wir fanden, dass sich eine spezielle Klasse von Etherlipiden, die Plasmalogene, in den Zellen mit verminderter AGMO Aktivität anreichern und spezielle Lipide längere und ungesättigtere Fettsäure-Seitenketten eingebaut hatten. Wir konnten auch signifikante Fortschritte in unserem Verständnis der Genetik der von uns hergestellten AGMO Knockoutmäuse erzielen. Durch das ständige Auffinden eines Wildtypsignals in der Genotypisierungs-PCR, waren wir anfänglich davon ausgegangen, dass Mäuse ohne AGMO nicht lebensfähig sind. Mittels einer neuartigen Sequenzierungsmethode für sehr lange DNA Sequenzen, dem Nanoporen-Sequenzieren, konnten wir dann aber zeigen, dass es während der Herstellung der AGMO Knockout-Stammzellproduktion zu einer Integration eines Stückes an Wildtyp-Gen im AGMO Lokus, wo sich die Knockoutkassette befindet, gekommen war. Dies führte zum ständigen Auffinden von Wildtyp PCR-Banden bei der Genotypisierung. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir eine alternative, quantitative PCR Methode aufgebaut, die nicht von der An- bzw. Abwesenheit des Wildtypsignals abhängt, sondern die Zahl der Knockout-Allelkopien zählt und dadurch eine eindeutige Zuordnung des korrekten Genotyps ermöglicht. Mittels dieses wichtigen Durchbruchs konnten wir die Knockouttiere dann charakterisieren. In den bisher getesteten Parametern zeigen diese keine Anomalitäten auf.