Elektronenweiterleitung

Das Projekt untersucht die Funktion der Cytochromdomäne (CYT) des Pilzenzyms Cellobiosedehydrogenase (CDH) als elektronenleitende Einheit für andere Oxidoreduktasen. Die Kombination vonCYT und verschiedenenGlukose-Methanol-Choline(GMC) Oxidoreduktasen zu chimären Flavocytochromen soll den Elektronenfluss vom katalytischen Zentrum zu einer Arbeitselektrode umleiten. Die Abhängigkeit der Enzyme von Kosubstraten wie Sauerstoff, Chinonen oder Redoxmediatorensolldadurchin einendirekten Elektronentransfer (DET) an die Arbeitselektrode ersetzt werden. Elektronen sind eine sehr kostengünstige und umweltfeundliche Art Reduktionsäquivalente zur Verfügung zu stellen. CYT-modifizierte GMC Oxidoreduktasen die einen schnellen und effizienten DET aufweisen, sind für Biosensoren und die Bioelektrokatalyse sehr interessant. Der Mechanismus und die Kinetik der Cytochromdomäneninteraktion mit drei GMC Oxidoreduktasen (Arylalkoholoxidase, Alcoholoxidase und Glukosedehydrogenase) wird vergleichend mit der der CDH untersucht werden. In weiterer Folge wird das Projekt auch die Interaktion von isolierten, auf Elektroden immobilisierten Cytochromdomänen mit freien, gelösten GMC Oxidoreduktasen und lytischer Polysaccharidmonooxygenase untersuchen.Hierbei dient die Cytochromdomäneals elektrischer Kontakt für diese Oxidoreduktasen. Das Projekt soll den Mechanismus der Domäneninteraktion untersuchen und den Einfluss der Cytochromdomänenorientierung und mobilität durch schnellebiochemischeund elektrochemische Methodenaufklären. Schlussendlich soll über die Eignung der hergestellten CYT-GMC Chimären und der CYT- modifizierten Elektroden für Biosensoren und die Bioelektrokatalyse befunden werden.

Die Kernaufgabe des Projekts bestand darin, neue Wege zum Einsatz von Enzymen in Biosensoren zu erforschen. Enzyme übernehmen in Biosensoren die Aufgabe eines spezifischen Detektors, der selbst in komplexen Medien wie Nahrungsmitteln oder medizinischen Proben den Analyten (die zu bestimmende Substanz) mit hoher Spezifität erkennt und dessen Konzentration mit hoher Genauigkeit bestimmt. Die Verbindung von Enzym mit der Messelektrode ist hierfür sehr wichtig, ist aber nur selten der Gegenstand von Grundlagenforschung. Im Projekt "Electron flow" haben wir Enzyme der GMC-Oxidoreduktase Familie untersucht, die vielfach in Biosensoren, z.B. zur Messung von Blutglukose, zur Anwendung kommen. Die Elektronen die in der Nachweisreaktion (Glukose wird zu Glukonsäure oxidiert) freigesetzt werden, können über Mediatoren zur Elektrode weitergeleitet werden, was aber häufig durch Störsubstanzen gestört wird. Durch die Etablierung eines direkten Kontakts des Enzyms mit der Messelektrode wird das vermieden. Dazu bedarf es aber eines gekoppelten Elektronentransferproteins. In der Natur erfüllen verschiedene Cytochrome diese Funktion. Die Forscherinnen und Forscher des Projekts haben daher mit bioinformatischen Methoden aus über 1500 Cytochromen acht passende ausgewählt, hergestellt und charakterisiert. Cytochrome aus Bakterien und Pilzen mit einem passenden Redoxpotential und einer guten Elektronenweiterleitung wurden mit verschiedenen molekularbiologischen und biochemischen Methoden an das Enzym Glukosedehydrogenase gekoppelt um den gewünschten direkten Elektronentransfer zu erzielen. Die geschaffenen Fusionsenzyme zeigen das gewünschte Verhalten, aber in noch zu geringem Ausmaß für die kommerzielle Verwertung. Im Projekt wurden weiterführende Möglichkeiten zur Verbesserung des Elektronentransfers mit Hilfe von Simulationen untersucht und Lösungsansätze zur Erhöhung der Sensorsensitivität erarbeitet. Eine Kombination aus Proteinengineering am Interface der beiden Proteine und verbesserten Immobilisierungsverfahren der Enzyme auf der Elektrode wird für zukünftige Foschungs- und Entwicklungsprojekte empfohlen.