Mechanismen der Ligandenselektivität in Monoamintransportern

Der Serotonintransporter (SERT), der Dopamintransporter (DAT) und der Noradrenalintransporter (NET) regulieren monoaminerge Neurotransmission. Ihre Aufgabe ist es, ausgeschüttete Monoamine zurück in die Neuronen zu holen. Diese Transporter sind wichtige Angriffspunkte für die Therapie von Depressionen und anderen psychischen Störungen. Um verbesserte Medikamente zu entwickeln, ist es wichtig, den Mechanismus ihrer Bindung an die Monoamintransporter im Detail zu verstehen. Die Selektivität der Bindung spielt in diesen Zusammenhang eine besonders wichtige Rolle. Zum Beispiel sollten Antidepressiva eher auf den SERT wirken und weniger auf den DAT. Umgekehrt sollten Medikamente für die Behandlung von Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung auf DAT und NET wirken und weniger auf SERT. Es ist schon vieles unternommen worden, um die Ligandenselektivität besser zu verstehen. Ursprünglich hat man angenommen, dass diese hauptsächlich durch Unterschiede in den Dissoziationsraten der Medikamente erklärt werden kann. Kürzlich hat jedoch ein Koautor dieses Antrags (Dr Walter Sandtner) herausgefunden, dass auch die Assoziationsrate für die Selektivität wichtig ist. Das lässt sich am besten erklären, wenn man annimmt, dass ein Selektivitätsfilter in Monoamintransportern existiert.Dieser Selektivitätsfilter beinhaltet wahrscheinlich zusätzliche Ligandenbindungsstellen, welche im Eingangsbereich zur Hauptbindungstelle liegen. Der Antragsteller hat eine kraftspektroskopische Methode entwickelt, mit der man einzelmolekulare Bindungsereignisse detektieren kann. Diese Methode erlaubt auch, die Bindungskinetik vonLiganden an Monoamintransportern zu messen. Der Antragsteller hat vor kurzem gezeigt, dass er so die Dissoziationsrate des Antidepressivums Citalopram messen kann und dass die Werte gut mit den ResultatenelektrophysiologischerMessungenübereinstimmen.EineinzigartigerVorteil der kraftspektroskopischen Methode war die Entdeckung und Charakterisierung einer zweiten Bindungstelle, die im Eingangsbereich zur Hauptbindungstelle liegt. Das wäre zur Zeit mit keiner Methode möglich gewesen. In diesen Antrag wird vorgeschlagen, die Assoziationsraten-getriebene Selektivität sowohl mit Einzelmolekül-Kraftspektroskopie als auch mit elektrophysiologischen Methoden zu untersuchen. Es wird außerdem angestrebt, jene Strukturen zu identifizieren, welche für die Bildung des Selektivitätsfilters wichtig sind.

Die Monoamintransporter sind wichtige Angriffspunkte für die Therapie von Depressionen, Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung und anderen psychischen Störungen. Um verbesserte Medikamente zu entwickeln, ist es wichtig, den Mechanismus ihrer Bindung an die Monoamintransporter im Detail zu verstehen. Die Selektivität der Bindung spielt in diesen Zusammenhang eine besonders wichtige Rolle. Es ist schon vieles unternommen worden, um die Ligandenselektivität besser zu verstehen. Ursprünglich hat man angenommen, dass diese hauptsächlich durch Unterschiede in den Dissoziationsraten der Medikamente erklärt werden kann. Kürzlich hat jedoch Dr. Walter Sandtner herausgefunden, dass auch die Assoziationsrate für die Selektivität wichtig ist. Das lässt sich am besten erklären, wenn man annimmt, dass ein Selektivitätsfilter in Monoamintransportern existiert. Dieser Selektivitätsfilter beinhaltet wahrscheinlich zusätzliche Liganden-bindungsstellen, welche im Eingangsbereich zur Hauptbindungstelle liegen. Wir untersuchten den Selektivitätsfilter mithilfe der Einzelmolekül-Kraftspektroskopie basierend auf Rasterkraftmikroskopie (AFM) und mithilfe der elektrophysiologischen Messungen. Viele Arzneimittelmoleküle wie Desipramin haben eine sekundäre Amingruppe anstelle einer primären Amingruppe, für die kein veröffentlichtes Verfahren zur Funktionalisierung der AFM-Spitze vorhanden ist. In diesem Projekt haben wir die Chemie zur Verknüpfung von Desipramin an die AFM-Spitze durch die Reaktion zwischen Bromacetat und dem sekundären Amin von Desipramin entwickelt, dadurch einen neuen Weg für die Funktionalisierung von AFM-Spitzen mit Wirkstoffmolekülen ebnete. Aus den Kraftmessungen haben wir herausgefunden, dass die Dissoziationsrate von Desipramin für beide Transporter von Dopamin (DAT) und Serotonin (SERT) ähnlich war. Allerdings war die Assoziationsrate von Desipramin bei SERT etwa sechsmal höher als bei DAT. Daher wird die Selektivität von Desipramin für SERT gegenüber DAT hauptsächlich durch seine Assoziationrate und nicht durch seine Dissoziationsrate bestimmt. Durch die Verwendung von Antikörperfragmenten, die auf die extrazelluläre Schleife 2 (EL2) und 4 (EL4) der Transporter binden, fanden wir heraus, dass die Besetzung von EL2 und EL4 die Assoziationsrate von Desipramin für SERT, aber nicht für DAT reduzierte, mit vernachlässigbarer Wirkung auf die Dissoziationsrate, was darauf hindeutet EL2 und EL4 tragen zum Selektivitätsfilter bei, der den Eintritt von Desipramin in die primäre Bindungsstelle von SERT erleichtert. Mithilfe der elektrophysiologischer Messungen erweiterten wir die Erforschung des Selektivitätsfilters auf Methylphenidat, das ein selektiver Inhibitor von DAT ist. Die Ergebnisse zeigten, dass der EL4-Antikörper und sein Fragment den anfänglichen substratinduzierten Übergang von der nach außen gerichteten zur nach innen gerichteten Konformation, aber nicht den Vorwärtszyklusmodus von SERT behinderten. Im Gegensatz dazu verstärkte die Besetzung von EL2 mit Antikörperfragment die Affinität von SERT für Methylphenidat durch Beschleunigung der Assoziationsrate. Dies wurde durch Untersuchung der Bindung bestimmter radioaktiv markierter Inhibitoren an SERT bestätigt. Basierend auf all diesen Beobachtungen schließen wir, dass EL2 und EL4 den Zugang von Inhibitoren zur Bindung von SERT und DAT kontrollieren und somit als Selektivitätsfilter wirken. Diese Erkenntnisse haben Auswirkungen auf die Medikamentenentwicklung.