3D Lithographiestrukturen zur Zelldifferenzierung

Der Schlüssel zum besseren Verständnis der maßgeblichen biologisch-funktionalen Prozesse bei der Interaktion von Zellen, die während der Differenzierung (z.B. Osteogenese) stattfinden, ist die Entwicklung von Modellsystemen der extrazellulären Matrix. Derzeit ist die Analyse von Zellinteraktionen auf entweder totes Gewebe und/oder ex-vivo Kokultivierung beschränkt. Damit können interagierende Zellstrukturen nur in zwei Dimensionen untersucht werden. Eine auf zwei Dimensionen begrenzte Kultivierung der Zellen ändert aber nachweislich die Proteinverteilung, das Zellverhalten und die Signalwege. Darüber hinaus sind die Zellen wahllos in die umgebende Matrix eingebettet, wodurch die mikroskopische Analyse der molekularen Interaktionen zwischen den verschiedenen Zellen erschwert wird. Ein dreidimensionales Zellträgersystem, das die molekulare Charakterisierung der Zelldifferenzierung sowohl auf Einzelzellebene als auch im Gewebekontext ermöglicht, ist daher sehr wünschenswert. Das Hauptaugenmerk dieses Projektes wird auf der Entwicklung von dreidimensionalen Zellgerüsten liegen. Die mit Nanolithographie geschriebenen Gerüste imitieren die extrazelluläre Matrix. Dies erst ermöglicht eine gezielte Zelldifferenzierung und eine darauffolgende Charakterisierung von mesenchymalen Stammzellen (Osteogenese) auf nanoskopischer Ebene. Hierfür ist die Anwendung neuer 3D-Lithographiemethoden geplant. Dadurch wird es möglich, die Größe der Polymerstrukturen in drei Dimensionen von 100 Mikro- bis auf einige Nanometer zu variieren. Zusätzlich werden die mechanischen Eigenschaften der Polymerstrukturen sowie die spezifische Funktionalisierung mit Zelladhäsion- und Differenzierung-vermittelnden Biomolekülen kontrolliert werden. Das Projektkonsortium umfasst alle für dieses Projekt relevanten Expertisen, nämlich Multiphotonenlithographie, Einzelmolekülmikroskopie, Lokalisationsmikroskopie und Biophysik (technische Expertise des Departments für Medizintechnik an der FH Linz), sowie am für Angewandte Physik der JKU die STED-Lithographie (einziges Institut in Österreich) sowie die Oberflächen- und Polymerchemie. Eine enge Zusammenarbeit mit dem Ludwig-Boltzmann Institut für Experimentelle und Klinische Traumatologie (LBI) und der Abteilung für Geburtshilfe der Medizinischen Universität Wien - beide verfügen über langjährige Erfahrung in der Stammzellforschung und dem Gewebe- Engineering - wird uns bei der Zellkultivierung behilflich sein.

Dreidimensionale Gerüste sind im Tissue Engineering entscheidend, da sie biomimetische Umgebungen für das Wachstum und die Funktion von Zelltypen schaffen. Eine Herausforderung bleibt, die komplexen geometrischen und mechanischen Eigenschaften von Gewebe in einem Organ-on-a-Chip-Modell nachzubilden. In diesem Projekt entwickelten wir 3D-Gerüste, die die extrazelluläre Matrix (ECM) mithilfe von Multiphotonen- und STimulated Emission Depletion (STED)-Lithographie auf Nanometerebene nachahmen. Diese Gerüste ermöglichen die Co-Kultivierung verschiedener Zelltypen und die Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-Gerüst-Interaktionen auf nanoskopischer Ebene. Im Laufe des Projekts erzielten wir Fortschritte bei der Entwicklung von Methoden und Materialien für effizientes Photografting von Oberflächen sowie bei der Herstellung proteinbasierter Polymer-3D-Gerüste, die zur Zell-Differenzierung beitragen. Wir entwickelten Puffer, die die Effizienz photochemisch induzierter Oberflächenmodifikationen auf Molekülebene signifikant verbessern. Puffer mit paramagnetischen Kationen und radikalfördernden Sauerstoffverbindungen steigern die Laser-Assisted Protein Adsorption by Photobleaching (LAPAP) von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden oder Biotin auf 2D- und 3D-MPL-Gerüsten. Die Effizienz des Photopaintings wurde mithilfe der Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie quantifiziert. Wir entwickelten proteinbasierte Photoresists (Streptavidin-, Rinderserumalbumin - basiert) unter Verwendung von Vernetzern wie Polyethylenglycoldiacrylat und methacryliertem Hyaluronsäure, kombiniert mit einem vitaminbasierten Photoinitiator. Darüber hinaus setzten wir 2D/3D-Direktlaser-Schreibtechniken ein, um wasserlösliche, proteinbasierte Gerüste mit anpassbaren mechanischen Eigenschaften herzustellen. Die resultierenden Gerüste zeigten Young'sche Moduli von 80 MPa für künstliche Polymere bis zu 40 kPa für proteinbasierte Materialien, mit Strukturelementen unter 100 nm. Michler's Ethylketon wurde für STED-inspirierte MPL verwendet, wodurch Strukturen von 40 nm mit geringer Autofluoreszenz im sichtbaren Bereich erzeugt wurden, was es ideal für Protein- oder Zellgerüste macht. Die funktionelle Charakterisierung mittels fluoreszenzmarkiertem Biotin und Antikörpern bestätigte ihre Bioaktivität. Wir nutzten neueste Entwicklungen zur Herstellung hybrider Gerüste, indem wir künstliche polymer- und proteinbasierte Photoresists mithilfe von MPL kombinierten. Die Polymerstrukturen aus BisSR, Carboxyethylacrylaten und methacryliertem Kollagen Typ I ermöglichten eine präzise Kontrolle der Gerüstarchitektur für verbesserte Tissue-Engineering-Anwendungen. Diese 3D-submikron-strukturierten Gerüste (~300 m) wurden erfolgreich zur Kultivierung mesenchymaler Stammzellen (MSCs) eingesetzt. Bildgebung von Aktin und Vinculin bestätigte die Biokompatibilität, und die Differenzierung der MSCs zu Osteoblasten zeigte ihr Potenzial für die Knochengewebszüchtung.