Funktion von MNX1 bei Bildung und Funktion von ß-Zellen

Weltweit wird intensiv an Methoden zur effizienten Wiederherstellung von ß-Zellen in Diabetes Patienten geforscht. Einer der derzeit favorisierten Ansätze ist die Bildung von ß- Zellen aus Stamm- oder Vorläuferzellen mittels in vitro Differenzierung. Die Umwandlung von Stammzellen in funktionierende ß-Zellen ist jedoch schwierig und derzeit nicht sehr effizient. Fundamentale Voraussetzung für eine erfolgreichere Programmierungsstrategie sind genaue Kenntnisse der molekularen Vorgänge bei Bildung und Erhaltung der ß- Zelleigenschaften. Ziel dieses Antrags ist die Aufklärung von neuen Mechanismen und Regulatoren der ß- Zellbildung mittels Analyse der molekularen Funktionen des Mnx1/Hb9 Transkriptionsfaktor. Mnx1 hat zentrale und evolutionär konservierte Funktionen bei Bildung und Funktion von ß- Zellen. Wie Mnx1 diese Funktionen auf molekularer Ebene umsetzt ist derzeit nicht bekannt. Basierend auf aktuellen Daten aus eigenen Studien am Modell Zebrafisch postulieren wir, dass Mnx1-Zielgene die Differenzierung von ß-Zellen unterdrücken, und dass Mnx1 diese Gene dauerhaft blockieren muss, damit sich ß-Zellen bilden und vollständig ausreifen können. Zur Überprüfung dieser These sollen Versuche im Zebrafisch und an humanen Stammzellen durchgeführt werden. Der Fisch dient als genetisches Modell zur Aufklärung von in vivo Funktionen und genetischen Interaktionen von Mnx1 und Mnx1-Zielgenen während in Stammzellen die molekularen Funktionen dieser Gene und deren mögliche Implikationen für den Menschen analysiert werden. Wir erwarten, dass unsere Versuche grundlegend neue Erkenntnisse in Bezug auf die Einleitung, Aufrechterhaltung und Plastizität von endokrinen Zellschicksalen liefern, und dass sie zu einem deutlich verbesserten Verständnis der ß-Zelldifferenzierung führen. Darüber hinaus erwarten wir, dass diese neuen Einblicke verbesserte Strategien bei der Herstellung funktionaler humaner ß-Zellen mittels Reprogrammierung ermöglichen.

Die Bildung von Insulin-produzierenden -Zellen folgt einem evolutionär konservierten genetischen Programm. Versuche in Modellorganismen deuteten hierbei auf eine wichtige Rolle des Transkriptionsfaktor Mnx1 bei der Festlegung der -Zellen-Identität hin. Zu Beginn des Projekts war jedoch nicht bekannt, wie der Transkriptionsrepressor Mnx1 diese Aktivität auf molekularer Ebene umsetzt, und es gab Hinweise auf sehr unterschiedliche zelluläre Konsequenzen beim Verlust der Mnx1-Funktion in Fisch, Maus und Mensch. Entgegen dieser Annahmen konnten wir im Rahmen dieses Projekts zeigen, dass sowohl die molekularen pankreatischen Mnx1-Funktionen als auch die mutanten Phänotypen vom Zebrafisch bis hin zum Menschen konserviert sind. Unsere Studien ergaben, dass sich -Zellvorläufer zwar sowohl in mnx1-mutanten Zebrafischembryonen als auch aus MNX1-mutanten humane Stammzellen bilden können, sich diese dann aber nicht in -Zellen sondern in der Mehrzahl in -ähnliche Zellen weiterentwickeln. Darüber hinaus konnten mittels molekularer Analysen mehre konservierte direkte Mnx1-Zielgene mit Funktionen sowohl bei der generellen Unterbindung von Differenzierung als auch bei Etablierung des -Zellschicksals identifiziert werden. Unsere Versuche zeigen aber auch, dass sich Insulin-exprimierende Zellen auch unabhängig von Mnx1 bilden können, und dass sich diese Zellen grundlegend von -Zellen unterscheiden. Während die mnx1-mutanten Zebrafische in den ersten 2-3 Wochen ihrer Entwicklung kaum Insulin produzieren und entsprechend hyperglykämisch sind, zeigen ältere Tiere fast normale Blutzuckerwerte. 'Single-cell RNAseq' und histologische Analysen bestätigen, dass ältere Tiere die fehlenden -Zellen durch massive Bildung von Somatostatin/Insulin co-exprimierenden Zellen kompensieren, und dass diese Kompensation ähnlich wie auch in Mnx1-mutanten Mäusen beschrieben, mit einer generellen Umstrukturierung und dem massiven Wachstum der Bauchspeicheldrüse korreliert. Neben diesen wichtigen Erkenntnissen zur beta-Zellbildung, lieferten die Versuche auch eine Reihe unerwarteter Erkenntnisse. So zeigte sich, dass sowohl der Mensch als auch der Fisch zwei unterschiedlich lange Mnx1 Proteine exprimiert, und dass alle bisher im Fisch beschriebenen knock-down Phänotypen auf dem Verlust von nur einer dieser Isoformen basieren. Desweitern ergaben die 'single-cell' Analysen der humanen in vitro Differenzierungsansätze mehrere Hinweise auf bisher unbekannte MNX1-Funktionen auch außerhalb der -Zelldifferenzierung. Zusammenfassend etablieren diese Daten Mnx1 als die zentrale Kontrollinstanz einer effizienten Umsetzung der -Zelldifferenzierung und sie weisen Mnx1 weitere bisher nicht bekannte direkte und indirekten Funktionen bei der endodermalen Differenzierung zu.