Untersuchung des ER-Golgi Interface mittels Arabidopsis MNS3

Das Projekt Untersuchung des ER-Golgi Interface mittels Arabidopsis MNS3 untersucht die Endoplasmatisches Reticulum (ER) alpha-Mannosidase MNS3 aus der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Dieses Enzym ist Teil der Maschinerie für die Asparagin-(N)-verknüpfte Glykosylierung von Proteinen, welche eine (biologisch) wichtige Proteinmodifikation in Eukaryonten ist und sukzessive im ER und Golgi Apparat abläuft. Das prozessierende Enzym MNS3 generiert eine oligo- mannosidische N-Glykanstruktur, die primär auf ER-residenten Proteinen zu finden ist. Das Enzym selbst sitzt jedoch nicht im ER, sondern befindet sich laut unserer Vorarbeiten in einem Kompartiment des Golgi Apparats, welches dem ER zugewandt und resistent gegen gängige chemische und genetische Mittel ist, die zu einem Zerfall des Golgi Apparats führen. Solch ungewöhnliches Verhalten wurde bis jetzt nur für wenige andere Proteine beobachtet, welche möglicherweise in demselben Golgi-Kompartiment sitzen. Laut unserer Hypothese befindet sich MNS3 zusammen mit diesen Proteinen in einem bis jetzt nicht charakterisierten Membrankompartiment innerhalb des ER- Golgi-Interface, welches funktionell mit dem ER-Golgi-Intermediärkompartiment (ERGIC) der Säuger verwandt sein könnte. Dieses subzelluläre Kompartiment könnte die Proteinsortierung erleichtern und als Gerüst für die Biogenese des Golgi Apparats dienen. Dieses Projekt zielt darauf ab, (1) den exakten Aufenthaltsort von MNS3 innerhalb des bis jetzt wenig charakterisierten ER-Golgi- Interface zu bestimmen, (2) die ungewöhnliche subzelluläre Lokalisation im Golgi mit ihrer biosynthetischen und biologischen Funktion einer ER-typischen Mannosidase in Einklang bringen, und (3) die zu Grunde liegenden Lokalisationsmechanismen zu ermitteln. Wir werden die ModellpflanzenNicotiana benthamiana und Arabidopsisthaliana einsetzen, um mittels zellbiologischer, biochemischer und genetischer Methoden die funktionelle Relevanz dieser ungewöhnlichen subzellulären Kompartimentierung in Pflanzen zu beleuchten. Wir erwarten uns, dass die Ergebnisse dieses Projekts Zellbiologen aus den unterschiedlichsten Bereichen dabei helfen, die Mechanismen, welche den Transport von Proteinen entlang des sekretorischen Wegs kontrollieren, besser zu verstehen. Das Wissen um diese Mechanismen und die Regulation der damit im Zusammenhang stehenden biosynthetischen Funktionen in Pflanzen ist deshalb so wichtig, da Pflanzen in biotechnologischer und industrieller Hinsicht ein großes Potential bergen, z.B. bei der Produktion von pharmazeutisch wichtigen Proteinen (z.B. Antikörpern), welche meist stark N- glykosyliert sind und den sekretorischen Weg durchwandern.

Das Protein MNS3 aus der Modellpflanze Arabidopsis thaliana ist eine Mannosidase, die eine Schlüsselrolle bei der Verarbeitung von N-Glykanen spielt. N-Glykane sind Kohlenhydratgruppen (Zuckergruppen), die während der Glykosylierung an Proteine angehängt werden. Die Glykosylierung ist eine der am weitesten verbreiteten Formen der Proteinmodifikation in allen Eukaryonten. Sie beeinflusst zahlreiche biologische Prozesse und findet hauptsächlich im Endoplasmatischen Retikulum (ER) und im Golgi-Apparat statt, zwei spezialisierten Membrankompartimenten innerhalb der Zelle. MNS3 produziert eine Zuckerstruktur, die hauptsächlich auf Glykoproteinen im ER zu finden ist, aber überraschenderweise ist das Enzym nicht im ER lokalisiert. Ziel dieses Projektes war es, die genaue Lokalisation von MNS3 in Pflanzenzellen zu bestimmen, insbesondere im Bereich zwischen ER und Golgi. Wir wollten auch verstehen, wie diese Lokalisierung mit den biosynthetischen Aufgaben von MNS3 vereinbar ist und wie MNS3 seinen Aufenthaltsort in der Zelle erreicht. Wir haben ein bisher unbekanntes Signal entdeckt, das für die Lokalisierung und den Aufenthalt von MNS3 im Golgi verantwortlich ist. Diese Golgi- Lokalisierung führt zu einer strikten räumlichen Trennung von den im ER lokalisierten Mannose-prozessierenden Schritten im ER, die das Glykan-Signal für die Markierung und den anschließenden Abbau terminal fehlgefalteter Glykoproteine erzeugen. Dadurch wird ein zufälliger (im Gegensatz zu einem gezielten) Abbau von Glykoproteinen im ER verhindert. Darüber hinaus haben wir verschiedene Methoden eingesetzt, um Proteine zu identifizieren, die an dieses neue Signalmotiv binden können. Wir erhielten eine Reihe von Kandidaten, die im ER und Golgi lokalisiert sind und bekannte regulatorische Funktionen bei der Auswahl und dem Transport von Cargoproteinen haben. Unter diesen Kandidaten haben wir ein wichtiges regulatorisches Protein mit einer Funktion im Proteintransport zwischen ER und Golgi identifiziert. Die Überexpression dieses Proteins führte zu einer Erhöhung der Konzentration mehrerer koexprimierter Proteine. Arabidopsis-Mutanten, denen dieses Protein fehlte, zeigten eine veränderte Morphologie des Golgi-Apparates und eine hochregulierte Expression eines Gens, das an der Bildung von Transportvehikeln zwischen ER und Golgi beteiligt ist. Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass ein Anstieg des identifizierten Proteins eine sekretorische Reaktion in Pflanzenzellen auslöst, was auf eine neue regulatorische Funktion dieses Proteins hinweist. Diese Erkenntnisse ermöglichen die Weiterentwicklung molekularer Werkzeuge zur gezielten Steigerung der Proteinexpression in Pflanzen weiterzuentwickeln, die ein enormes biotechnologisches und industrielles Potenzial für die Produktion rekombinanter, pharmazeutisch relevanter Glykoproteine besitzen.