Ein neuer Signalkomplex durch die bakterielle Zellhülle

Bakterien besitzen eine Zellhülle, welche vor ungünstigen Umwelteinflüssen wie z.B. Antibiotika schützt. Die Zellhülle Gram-negativer Bakterien wie E. coli besteht aus der äußeren Membran, dem Periplasma mit der Peptidoglykanschicht und der Zytoplasmamembran. Um die Funktion der Zellhülle sicherzustellen, müssen Bakterien diese überwachen und, falls notwendig, Gene für deren Synthese und Reparatur aktivieren. Bakterien nehmen ihre Umwelt durch Zweikomponentensysteme (ZKS) wahr. Diese bestehen aus Histidinkinasen in der Zytoplasmamembran, welche Umweltreize detektieren und zugehörige Antwortregulatoren durch Phosphorylierung aktivieren. Die Antwortregulatoren initiieren ein Genexpressionprogramm, das eine Anpassung an die veränderten Umweltbedingungen erlaubt. Das ZKS QseE/QseF ist in Enterobakterien konserviert und kontrolliert Funktionen für die Synthese und Erhalt der Zellhülle. Darüberhinaus ist QseE/QseF für die Virulenz pathogener Arten essenziell. Vor Kurzem entdeckten wir, dass QseE/QseF für seine Funktion das Protein QseG als dritte Komponente benötigt. QseG ist ein Lipoprotein, welches an der Innenseite der äußeren Membran verankert ist und mit der periplasmatischen Domäne der Kinase QseE interagiert, wodurch aller Evidenz nach die Phosphorylierung des Antwortregulators QseF ausgelöst wird. Wir vermuten, dass QseG ein Signal in der äußeren Membran, möglicherweise einen Defekt, wahrnimmt und diese Information in das Zytoplasma weiterleitet, um Gene zu aktivieren, die die Integrität der Zellhülle gewährleisten. Genetische Daten lassen vermuten, dass ein unbekannter Faktor im Periplasma QseG sequestriert und hierdurch dessen Verfügbarkeit zur Interaktion reguliert. Dieser Faktor soll durch Pull-down und genetische Screens identifiziert werden. Wir spekulieren, dass QseG und QseE einen Komplex ausbilden, der das Periplasma durchspannt, um die Phosphorylierung von QseF zu kontrollieren. Diese Möglichkeit soll durch Manipulation des Abstands der äußeren zur inneren Membran untersucht werden. Für eine bessere Einsicht in den zu Grunde liegenden Mechanismus wollen wir die QseG Struktur aufklären und die Interaktionsdomänen in QseG und QseE durch Mutationsanalyse und Photo-Crosslinking identifizieren. Durch Analyse des Transkriptoms und DNA- Bindestudien soll untersucht werden, ob über die bereits bekannten Targets hinaus weitere Gene durch das Qse System reguliert werden. Zudem wollen wir die Rolle einer zweiten Phosphorylierung in QseF aufklären, welche möglicherweise weitere Informationen in diesen Signaltransduktionsweg integriert. Zusammengenommen schlagen wir vor, ein neuartiges Dreikomponentensystem zu erforschen, welches ein Signal über drei zelluläre Kompartimente hinweg weiterleitet, um Gene für die Zellwandhomöostase zu aktivieren. Ein vertieftes Verständnis, wie Bakterien ihre Zellhülle intakt halten und vor Schäden schützen, ist es von höchster Wichtigkeit, um neue Strategien zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionskrankheiten zu entwickeln.

Das Lipoprotein QseG, die Kinase QseE und der Responseregulator QseF bilden ein Drei-Komponenten-System, das die Expression der kleinen RNA (sRNA) GlmY in Escherichia coli K-12 reguliert. GlmY dient als Köder für das RNA-bindende Adapterprotein RapZ. Solange RapZ nicht an GlmY gebunden ist, bindet es die homologe sRNA GlmZ und präsentiert sie der Endoribonuklease RNase E zum Abbau. GlmZ wiederum reguliert die Expression des Enzyms GlmS, welches Glukosamin-6-phosphat (GlcN6P) synthetisiert, ein essenzielles Metabolit, das für die Synthese der Zellhülle benötigt wird. Wir entdeckten, dass RapZ je nach Verfügbarkeit von GlcN6P dynamisch mit QseG/QseE/QseF interagiert und einen Vier-Komponenten-Signalkomplex ausbildet. Wenn der GlcN6P-Spiegel sinkt, stimuliert RapZ die Phosphorylierung von QseE/QseE durch Interaktion, wodurch die glmY-Expression erhöht wird. Dadurch wird RapZ durch GlmY in stabilen Komplexen sequestriert, wodurch GlmZ intakt bleibt und die Expression von glmS durch Basenpaarung aktivieren kann. Die erhöhten GlmS-Mengen führen zur Resynthese von GlcN6P, welches RapZ bindet und GlmY aus dem Komplex verdrängt. GlmY wird dann rasch abgebaut. Strukturaufklärungen gaben Einsicht in die Architektur des RapZ:GlmZ-Komplexes und enthüllten überlappende GlcN6P- und sRNA-Bindungsstellen. Weitere Arbeiten suggerieren, dass RapZ ein "Moonlighting-Protein" ist und die Dephosphorylierung von GlcN6P katalysieren kann. Dadurch bleibt eine Fraktion der RapZ-Moleküle stets frei von GlcN6P und kann den Abbau von GlmZ katalysieren, selbst wenn GlcN6P reichlich vorhanden ist. Die Aufklärung der Struktur des RapZ:GlmZ:RNase E-Komplexes eröffnet eine Perspektive, wie andere RNA-bindende Proteine ihre Substrate der RNase E präsentieren könnten. Während RapZ als Modulator fungiert, ist QseG für die QseE/QseF-Phosphorylierung unerlässlich. Screens ergaben, dass QseG via QseE/QseF die Expression von glmY in Antwort auf verschiedene Zellhüllstressfaktoren aktiviert. Interessanterweise führen diese höheren GlmY-Mengen nicht zwangsläufig zu einer Aktivierung der GlmS-Expression durch GlmZ, was möglicherweise auf gleichzeitig erhöhte RapZ-Spiegel zurückzuführen ist, wodurch GlmZ abgebaut wird. QseG bindet QseE durch eine Region in der Nähe des N-terminalen lipidierten Restes, der QseG in der äußeren Membran verankert. Diese Beobachtung widerspricht der Idee eines "Trans-Envelope-Komplexes" und deutet auf eine Aktivierung von QseE durch QseG, wenn Letzteres im Periplasma akkumuliert - vermutlich als Reaktion auf Stress. Zeitaufgelöste RNA-seq-Analysen zeigten, dass glmY das einzige direkte Zielgen ist, das unter Standardwachstumsbedingungen durch QseF reguliert wird. Eine bestimmte Gruppe von Genen wird jedoch zu einem späteren Zeitpunkt hochreguliert, was auf einen anderen Regulationsmechansismus als DNA-Bindung hinweist. Schließlich entwickelten wir ein auf RapZ und GlmZ basierendes Tool, das es ermöglicht, sRNAs der Wahl in 5'-monophosphorylierten Zustand durch regulierte Prozessierung aus längeren Vorläufer-RNAs in der Zelle freizusetzen. Mit Hilfe dieses Werkzeugs konnten wir keine Rolle der 5'-Phosphorylierung beim Abbau von Target RNAs beobachten, wie dies zuvor von anderen Forschern vorgeschlagen wurde. Stattdessen wird die Stabilität einer bestimmten Gruppe von sRNAs offenbar durch ihren 5'-Phosphorylierungszustand bestimmt.