Mechanismen der Chromatinregulation durch Lamine

Die Verpackung des menschlichen Genoms in Chromatin und die Positionierung von Genomregionen in bestimmten Bereichen des Zellkerns wird zunehmend als wichtiger regulatorischer Mechanismus zur Kontrolle der Genexpression in verschiedenen zellulären Prozessen erkannt. Neben bekannten Genom-regulierenden Proteinen werden zunehmend auch Lamine als wesentliche Komponenten in Genom-regulierenden Vorgängen beschrieben. Lamine sind strukturelle Proteine im Zellkern, die stabile Netzwerkstrukturen an der Kernhülle bilden und für die mechanische Stabilisierung des Kernes sorgen. Es ist auch bereits sehr gut erforscht, dass die Laminfilamente dicht-gepackte Chromatinabschnitte an der Kernhülle verankern und damit zur Stilllegung von Genen beitragen. Unsere Forschungsgruppe interessiert sich für einen, bisher wenig untersuchten, dynamischen Anteil der zellulären Lamine, der sich im Gegensatz zu den stabilen peripheren Filamenten im gesamten Kern verteilt. Unsere früheren Arbeiten haben gezeigt, dass diese mobilen Lamine durch ein Chromatin-bindendes Protein, das Lamin-assoziierte Polypeptide 2 (LAP2)alpha, reguliert werden. Wir konnten zeigen, dass LAP2alpha-Lamin Komplexe nicht, wie die peripheren Filamente, an dicht-gepacktes Chromatin, sondern an offene, aktive Chromatinregionen binden. Eine Reduktion der mobilen Laminkomplexe veränderte die gesamte Chromatinstruktur. Aufgrund verschiedener Vorversuche stellten wir die Hypothese auf, dass Komplexe von Laminen und LAP2alpha die Zugänglichkeit von Chromatin regulieren können. In diesem Projekt wollen wir die molekularen Mechanismen identifizieren, die diese wichtige Chromatinregulation durch Lamine und LAP2alpha vermitteln. Zunächst werden wir durch eine Reihe von genomweiten molekularbiologischen und bioinformatischen Tests untersuchen, wie sich die Chromatinzugänglichkeit durch Entfernung von LAP2alpha verändert und wie diese Änderung mit der Veränderung der Chromatinbindung von Laminen und der Genexpression korrelieren. Weiters werden wir die Proteindomänen von LAP2alpha identifizieren, welche die Chromatinzugänglichkeit vermitteln, und mittels Massenspektroskopie neue Interaktionspartner von LAP2alpha und Laminen im Chromatin identifizieren. Funktionelle Untersuchungen dieser Interaktionspartner in der Ab- und Anwesenheit von LAP2alpha werden uns wichtige Aufschlüsse über zelluläre Prozesse liefern die bei der Chromatinregulation durch LAP2alpha und Lamine beteiligt sind. Abschließend werden wir die physiologische Relevanz dieser Prozesse für die Zelldifferenzierung testen, indem wir die Chromatinzugänglichkeit während der Muskeldifferenzierung in kultivierten Zellen in Ab- bzw. Anwesenheit von LAP2alpha untersuchen und diese mit Defekten in der Differenzierung korrelieren. Zusammengefasst erwarten wir wichtige neue Einblicke in molekulare Mechanismen der Chromatinregulation, die im Hinblick auf die durch Laminmutationen verursachten genetischen Erkrankungen auch Hinweise über mögliche Krankheitsmechanismen liefern können.

Die Organisation von Chromatin im 3-dimensionalen Raum des Zellkerns ist ein wichtiger Mechanismus für die Regulierung zelltypspezifischer Gene. Während der Muskelregeneration zum Beispiel, beeinflußt die Chromatin Organisation die Aktivierung muskelspezifischer Gene um die Bildung neuer Muskelfasern aus Vorläuferzellen zu ermöglichen. Strukturproteine im Zellkern, sogenannte Lamine, sind wesentlich an der 3D-Organisation von Chromatin beteiligt. Eine Gruppe von Laminen bildet ein stabiles Proteinnetzwerk an der Kernperipherie, das inaktive Chromatinbereiche an der Peripherie verankert und zur Stummschaltung nicht-muskulärer Gene beiträgt. Im Gegensatz dazu bildet eine andere Gruppe von Laminen hochdynamische Komplexe mit dem Lamin-bindenden Protein, Lamin-assoziiertes Polypeptid 2 (LAP2)alpha, im Kerninneren. Diese Lamine binden an aktive Chromatinregionen und scheinen muskelspezifische Gene während der Muskeldifferenzierung zu regulieren. Allerdings sind weder die Mechanismen, wie Lamine mit Chromatin interagieren, noch ihre Auswirkungen auf die Genregulation erforscht. Unser Projekt untersuchte diese wichtigen Fragen. Durch die Herstellung mutierter Versionen von Laminen und LAP2alpha identifizierten wir die Regionen in den Proteinen, die an der Bindung aneinander und an ihrer Assoziation mit Chromatin beteiligt sind. Wir stellten fest, dass eine komplexe Kooperation verschiedener Proteinregionen eine Interaktion dieser Proteine reguliert. LAP2alpha verhinderte die Chromatinbindung von Laminen durch das Blockieren von gemeinsamen Bindungsstellen auf Chromatin und durch die Rekrutierung von Laminen in nicht Chromatin-gebundene Komplexe. Um die Funktion von LAP2alpha und Laminen bei der Regulierung muskelspezifischer Gene zu untersuchen, haben wir ein System zur Differenzierung von Muskelvorläuferzellen in Muskelfasern im Reagenzglas verwendet und die Interaktion von Laminen und LAP2alpha mit Chromatin im gesamten Genom untersucht. LAP2alpha als auch Lamine interagierten mit Chromatinbereichen außerhalb muskelspezifischer Gene in Muskelvorläuferzellen. LAP2alpha, nicht jedoch Lamine, lagerte sich in den frühen Stadien der Muskeldifferenzierung in Bereiche muskelspezifischer Gene um und förderte die Aktivierung dieser Gene. Die Deletion von LAP2alpha führte zu Defekten in der Expression dieser Gene und zu einer Ausbreitung der Lamine zu den Muskelgenen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass LAP2alpha die muskelspezifische Genexpression durch mindestens zwei Mechanismen reguliert, erstens durch die Förderung einer effizienten Aktivierung muskelspezifischer Gene und zweitens durch die Verhinderung der Ausbreitung von Laminen auf diese Gene. Insgesamt liefert unser Projekt neue Einblicke in die Mechanismen, wie die Lamin-Chromatin-Assoziation reguliert wird und wie sich dies auf die zelltypspezifische Genregulation auswirkt. Diese Erkenntnisse sind nicht nur wichtig für ein besseres Verständnis der Lamin-Funktionen, sondern könnten auch Hinweise auf neue Behandlungsmethoden für Muskelerkrankungen liefern, die durch Mutationen in den Laminen verursacht werden, wie etwa die Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie.