QCL-IR Proteinspektroskopie zur Analyse von Bioprozessen

Ziel dieses Projekts ist die Weiterentwicklung von Methoden zur laserbasierten Infrarot (IR)- Spektroskopie für die Proteinanalyse und die Anwendung und Etablierung der IR- Spektroskopie zur Überwachung und Qualitätskontrolle bei der Untersuchung von Bioprozessen. Die besonderen optischen Eigenschaften der Quantenkaskadenlaser (QCL) Lichtquellen ermöglichen neuartige Ansätze in der IR-Spektroskopie. Aufgrund der kohärenten Natur der QCL-Strahlung kann ein laser-basiertes Mach-Zehnder-Interferometer (MZI) realisiert werden, das die unabhängige Messung von Absorptions- und Brechungsindex-Spektren von Proteinen erlaubt. Innerhalb des Projekts wird durch diese Art der Spektrenaufnahme die Robustheit und Nachweißgrenze der Messungen verbessert. Es soll gezeigt werden, dass sich dadurch die praktischen Anwendungsbereiche der IR-Spektroskopie in der qualitativen und quantitativen Analyse von Proteinen erheblich ausweiten lässt. Anschließend wird das entwickelte MZI-Setup zur Untersuchung einzelner Bioprozessschritte in der rekombinanten Produktion eines Modelproteins eingesetzt. Bisher war eine solche Analysevon Bioprozessenmittels IR Spektroskopie aufgrundder geringen Proteinkonzentration während einzelner Prozessschritte nicht möglich. In dem geplanten Forschungsprojekt wird die QCL-IR Spektroskopie zur strukturbasierten Produktanalytik an wesentlichenPunkten desDownstream Prozesseseingeführt (Analytik der Proteinaggregate, Rückfaltungskinetik, Analytik der Downstream Prozessschritte sowie Kinetik derHäm-Einbindung) und anschließend auchzur Charakterisierung und Qualitätskontrolle der einzelnen Arbeitsschritte eingesetzt. Die Veränderungen der Struktur und Aktivität der Zwischenprodukte sowie des Endproteins können so analysiert und in Beziehung gesetzt, sowie die Einflüsse systematisch veränderter Prozessparameter untersucht werden. Als Resultat des Projekts soll eine QCL-IR-Toolbox der etablierten Methoden für produktunabhängige Untersuchungen und Überwachung von Bioprozessen geschaffen werden. Die gewonnenen Daten erweitern nicht nur das Prozessverständnis, sondern ermöglichen es, Zusammenhänge zwischen den Prozessparametern und der Produktmenge sowie den Qualitätsattributen zu identifizieren. Durch die Erstellung von Hybridmodellen aus mechanistischen und datengestützten Hypothesen können tiefgreifende Erkenntnisse über Prozessabläufe gewonnen werden, die eine modellbasierte Steuerung zur Optimierung der Downstream Prozessschritte erlauben.

Dieses Projekt beschäftigte sich damit, wie Laser-basierte Infrarotspektroskopie für die Prozessanalytik in der biotechnologischen Produktion - genauer gesagt im Downstream - verwendet werden kann. Eine der grundlegenden Herausforderungen im Downstream Processing ist, die richtige Faltung von biotechnologisch erzeugten Proteinen sicher zu stellen. Die dafür zur Verfügung stehende Prozessanalytik ist allerdings derzeit nicht in der Lage schnell und kontinuierliche Informationen zur Protein Sekundärstruktur zu liefern. Während konventionelle Infrarotspektroskopie in der Lage ist, die Sekundärstruktur von Proteinen zu identifizieren und quantifizieren, ist sie im Allgemeinen nicht empfindlich und robust genug, um dies auch bei den Bedingungen im Downstream Processing zu tun. Wenn durch die Laser-basierte Infrarotspektroskopie die Performance der Infrarotspektroskopie ausreichend verbessert werden kann, wird dadurch schnellere und effizientere Produktion ermöglicht. Hierzu wurden in diesem Projekt die besonderen Eigenschaften dieser Lichtquellen ausgenutzt: ihre hohe spektrale Leistungsdichte und ihre Kohärenz. Weiters wurde ein besonderes Augenmerk darauf gelegt, wie spektroskopische Daten in chemische Information umgewandelt werden können. Im Speziellen wurden Methoden für die chemometrische Datenverarbeitung mittels MCR-ALS (multivariate curve resolution - alternating least squares; dt. Multivariate Kurvenauflösung mittels alternierenden kleinsten Fehlerquadraten) verfeinert und erweitert. Im Zuge dieses Projekts konnte durch Verbesserung der Laser-basierten Infrarotspektroskopie und der Datenauswertung zum ersten Mal inline Infrarotspektroskopie in einer der wichtigsten Unit Operations im Downstream Processing gezeigt werden, nämlich während der Produktaufreinigung in der preparativen Flüssigkeitschromatographie. Weiters wurde durch verbesserte Datenauswertung auch in Anwesenheit von Medienkomponenten mit starkem Beitrag zum Infrarotspektrum (z.B.: Detergentien) ermöglicht, Denaturierungs-/Stabilitätsstudien an Proteinen zu zeigen. Ein grundlegender Fortschritt in der Infrarot-laserspektroskopie war die Entwicklung einer Balanced Detection Methode, die das Rauschen des Lasers weitestgehend kompensiert, und so eine deutliche Verbesserung des Detektionslimits erlaubt. Mit der Dispersionsspektroskopie wurde eine neue Methode für die Infrarotspektroskopie mit weiterem dynamischen Bereich als die konventionelle Flüssigkeitsspektroskopie erforscht.