Identifikation von Promotor-gebundenen Proteinfaktoren

In allen Organismen hängen Zelldifferenzierung und Überleben von der differentiellen Transkription ab, die an so genannten Kernpromotoren (englisch core promoters oder CPs) beginnt. CPs sind kurze Sequenzen um die Transkriptionsstartstellen (TSSs) der Gene herum, die aufgrund ihrer zentralen Rolle bei der Gentranskription oft als "Gateways to Transcription" bezeichnet werden, als Türen zur Transkription. Sie reichen aus, den Prä-Initiations-Komplexes (PIC) zusammenzufügen, um niedrige und aktivierte Transkriptionsniveaus zu ermöglichen. Trotz der Bedeutung der CPs beruht unser Wissen über sie weitgehend auf einigen wenigen, gut definierten CPs, obwohl es verschiedene Arten von CPs gibt, die sich in DNA Sequenz und Funktion unterscheiden. So ist bekannt, dass verschiedene CP-Typen der Taufliege (Drosophila melanogaster) eine hohe Spezifität gegenüber dem regulatorischen Input auf der Ebene von Enhancern und Cofaktor-Proteinen aufweisen. Für unser Projekt schlagen wir vor, systematisch Proteinfaktoren zu suchen, die an verschiedene CP- Typen gebunden sind und für die Funktionen dieser CPs benötigt werden. Wir verwenden Drosophila melanogaster Zellen als unser Hauptmodellsystem und schlagen vor, die Arbeit auf menschliche Zellen auszuweiten. Wir planen, Kandidatenproteine, die an die DNA verschiedener CP-Typen binden, durch Affinitätsreinigung und Massenspektrometrie zu identifizieren. Wir erwarten sowohl die gemeinsame als auch die differentielle Bindung von kanonischen PIC-Komponenten an die verschiedenen Kernpromotortypen, sowie neue Proteinfaktoren, die potentiell wichtig für die Funktion des Kernpromotors sind. Wir werden den Bedarf an differentiell gebundenen kanonischen PIC-Komponenten unddie Rolle neuartiger, an bestimmtenCP-Typenangereicherter Proteinfaktoren funktionell testen, indem wir die Transkription nach gezieltem Abbau dieser Faktoren messen. Dieses Projekt wird die erste systematische Identifikation von Proteinen ermöglichen, die an bestimmte Typen von CPs sowohl in der Taufliege als auch im Menschen gebunden sind, und die Rolle dieser Proteine bei der Transkriptionsregulation aufzeigen. Das ist wichtig um zu verstehen, welche Faktoren für die PIC-Assemblierung und Transkription von den verschiedenen Promotortypen benötigt werden. So werden wir beispielsweise die vermutete Universalität der kanonischen PIC-Komponenten, die Bedeutung neuer Faktoren und die Anforderungen der verschiedenen Faktoren an die verschiedenen Schritte der Transkription testen. Wir werden damit die Grundlagen der regulatorischen Besonderheiten besser verstehen, sowie die architektonische und funktionelle Vielfalt der CPs. Daher ist dieses Projekt auch für medizinische Forschung relevant: die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze über gezielte Manipulation der Genexpression basiert auf den molekularen Mechanismen, welche die Transkription spezifischer Gene steuern.

In allen Organismen hängen die Zelldifferenzierung und das Überleben von der unterschiedlichen Genexpression ab, die durch ein kompliziertes Zusammenspiel von spezialisierten DNA-Elementen und regulatorischen Proteinen streng reguliert wird. Eine Klasse von DNA-Elementen - so genannte Promotoren - befinden sich am Anfang von Genen und leiten die Gentranskription ein, d. h. das Kopieren der DNA des Gens in RNA. Promotoren funktionieren über regulatorische Proteine, die an Promotoren binden und die Polymerase II rekrutieren, die das Kopieren von DNA in RNA durchführt. Obwohl seit Jahrzehnten bekannt ist, dass Promotoren in Form und Funktion unterschiedlich sind, war bisher nicht bekannt, ob die verschiedenen Promotoren über ähnliche oder unterschiedliche Proteine und Mechanismen funktionieren. In diesem Projekt haben wir Proteine charakterisiert, die an verschiedene Promotortypen im Modellsystem Drosophila melanogaster binden. Wir fanden heraus, dass verschiedene Promotortypen tatsächlich unterschiedliche Gruppen von Proteinen binden - und funktionell von ihnen abhängen. Als wir zum Beispiel den Proteinfaktor TBP schnell abbauten, waren nur Promotoren vom Typ TATA-Box betroffen. Insgesamt könnten die unterschiedlichen Abhängigkeiten von verschiedenen Proteinen auch ein seit langem bestehendes Rätsel der Transkriptionsinitiierungsmuster erklären, die - bei allen Tieren - "focused" oder "dispersed", also konzentriert oder verteilt, sein können. Wir haben diese Arbeit auch auf Säugetierzellen ausgedehnt, indem wir einen funktionellen Screen entwickelt haben, der die Bestimmung von Faktoren ermöglicht, die die Transkription von verschiedenen Promotoren aktivieren können. Beide Teile wurden kürzlich in Fachzeitschriften mit Peer-Review veröffentlicht (Serebreni et al., EMBO Journal 2023 und Nemcko et al., Nature Methods 2024). Dieses Projekt lieferte die Grundlage für eine umfassende Annotation von Drosophila-Promotoren und promotorgebundenen Proteinen und führte als Erweiterung auf Säugetierzellen zur Entwicklung einer Hochdurchsatzmethode, die von uns und anderen verwendet wird. Insgesamt hat unsere Arbeit zu neuen Erkenntnissen über die Sequenz und Funktion von Promotoren und zu unserem Verständnis der Genexpression im Allgemeinen geführt.