Analyse der Funktionen multipler Interaktionen von STAC3

Die elektromechanischeKopplung(EC-Kopplung)ist ein fundamentalerProzess der Muskelphysiologie. Hierbei wird ein elektrisches Signal, das Aktionspotential eines Motoneurons, in eine mechanische Antwort, die Kontraktion eines Muskels, umgewandelt. An diesem Mechanismus sind spannungsabhängige Kalziumkanäle wesentlich beteiligt. Dabei handelt es sich um Proteinkomplexe, die sich aus einer porenbildenden Untereinheit (CaV1.1) und weiteren akzessorischen Untereinheiten zusammensetzen. Diese Kalziumkanäle werden durch die Änderung des Membranpotentials aktiviert, woraufhin sie zur Öffnung der mechanisch gekoppelten kalziumfreisetzenden Kanäle (Ryanodinrezeptoren; RyR1) des endoplasmatischen Retikulums führen. Das dadurch resultierende zytoplasmatische Kalziumsignal reguliert die Muskelkontraktion. Kürzlich wurde ein bisher unbekannter, wesentlicher Bestandteil des EC-Kopplungsapparates identifiziert: STAC3. STAC3 gehört zu einer Familie von Adapterproteinen, die Protein-Protein- Interaktionen und die Bildung von makromolekularen Signalkomplexen erleichtern. Des weiteren wurden Mutationen im STAC3-Gen mit einer schweren Muskelerkrankung, der Myopathie der amerikanischen Ureinwohner, in Verbindung gebracht. Es wurde festgestellt, dass STAC3 zwei Funktionen bei der EC-Kopplung hat: (1) es ist wesentlich für die Stabilität und Funktion von CaV1.1 und (2) es ist entscheidend für die Kommunikation zwischen CaV1.1 und RyR1. In einem früheren FWF-Projekt (T855) konnten wir zeigen, dass zwei verschiedene Regionen von STAC3 zwei unterschiedliche Wechselwirkungen mit CaV1.1 herstellen. In diesem vorgeschlagenen Projekt werden wir ein einzigartiges Skelettmuskelzell-Kulturmodell nutzen, in dem STAC3 genetisch entfernt wurde, um die spezifischen Funktionen der beiden unterschiedlichen STAC3/CaV1.1-Wechselwirkungen bei der EC-Kopplung von Skelettmuskeln zu identifizieren. Die vorgeschlagenen Experimente, einschließlich molekulargenetische Methoden, fortgeschrittene Mikroskopie-Techniken und Elektrophysiologie, ermöglichen es uns zu bestimmen, ob jede STAC3/CaV1.1-Wechselwirkung für jede STAC3-Funktion bei der EC-Kopplung verantwortlich ist oder ob beide STAC3/CaV1.1-Wechselwirkungen synergistisch zu beiden Funktionen beitragen. Darüber hinaus können wir mit der Generierung des STAC3-Nullmodells physiologische Konsequenzen neuartiger STAC3-Mutationen testen, welche mit der Myopathie der amerikanischen Ureinwohner in Verbindung gebracht wurden. Die erwarteten Ergebnisse werden die molekularen Funktionen der von STAC3 etablierten Wechselwirkungen bei der EC-Kopplung sowie die pathophysiologischen Mechanismen der Native American Myopathie aufzeigen. Das vorgeschlagene Forschungsprojekt wird daher helfen unser Verständnis für eines der grundlegenden Prozesse der Muskelphysiologie zu erweitern und die Beteiligung von STAC3 an einer seltenen Muskelerkrankung besser zu verstehen.

Die Erregungs-Kontraktions-Kopplung (Excitation-Contraction Coupling, EC-Kopplung) in der Skelettmuskulatur ist ein streng regulierter Prozess, der die Membrandepolarisation in die Freisetzung von Kalzium aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) umwandelt und letztlich zur Muskelkontraktion führt. Im Zentrum dieses Mechanismus steht der L-Typ-Kalziumkanal CaV1.1, der in der Membran der transversalen (T-)Tubuli lokalisiert ist. Er fungiert als Spannungssensor und interagiert direkt mit dem Ryanodinrezeptor Typ 1 (RyR1) in der SR-Membran. Das Adapterprotein STAC3 (SH3- und cysteinreiches Domänenprotein 3) hat sich als ein entscheidender Regulator dieses Prozesses herausgestellt. Genetische Studien haben gezeigt, dass Funktionsverlustmutationen im Stac3-Gen zu einer kongenitalen Myopathie führen - bekannt als STAC3-Störung - die durch ausgeprägte Muskelschwäche und eine gestörte EC-Kopplung gekennzeichnet ist. Obwohl STAC3 für die funktionelle Expression von CaV1.1 und dessen konformationelle Kopplung mit RyR1 als essentiell gilt, sind die molekularen Mechanismen, die diesen Funktionen zugrunde liegen, bislang nur unvollständig verstanden. Bemerkenswerterweise interagiert STAC3 mit zwei wichtigen zytoplasmatischen Regionen von CaV1.1: der intrazellulären II-III-Schleife und dem proximalen C-Terminus. Frühere Arbeiten betonten die Bedeutung der II-III-Schleife für die EC-Kopplung; jedoch sind die jeweiligen Beiträge der einzelnen Interaktionsdomänen bisher nicht eindeutig geklärt. Darüber hinaus blieb die Rolle von STAC3 bei der Modulation der biophysikalischen Eigenschaften der CaV1.1-Ströme - insbesondere ihrer ungewöhnlich langsamen Kanalöffnungskinetik - weitgehend unerforscht. Neue Erkenntnisse zu verwandten Proteinen der STAC-Familie (z.B. STAC1 und STAC2) legen nahe, dass diese Proteine die Inaktivierungskinetik von L-Typ-Kalziumkanälen wie CaV1.2 und CaV1.3 durch Unterdrückung der kalziumabhängigen Inaktivierung (CDI) modulieren können. Inwieweit STAC3 ähnliche regulatorische Funktionen bei CaV1.1 in der Skelettmuskulatur übernimmt - insbesondere in Bezug auf spannungsabhängige Inaktivierung (VDI) und Kanalöffnungskinetik - wurde bislang nicht direkt untersucht. Im Rahmen dieses Forschungsvorhabens untersuchten wir die doppelte Funktion von STAC3: (1) die Regulation der Oberflächenexpression von CaV1.1 und der EC-Kopplung über domänenspezifische Interaktionen sowie (2) die Modulation der Kinetik und Inaktivierungseigenschaften der CaV1.1-Ströme. Mittels Struktur-Funktions-Analysen, elektrophysiologischer Untersuchungen und patientenbasierten Mutationen zeigten wir, dass die Bindung von STAC3 an den C-Terminus von CaV1.1 für die Expression des Kanals und eine minimale EC-Kopplung unerlässlich ist, während die Interaktion mit der II-III-Schleife die Effizienz der Kopplung verbessert. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass STAC3 das biophysikalische Profil von CaV1.1 formt, indem es die spannungsabhängige Inaktivierung unterdrückt und die Kanalöffnung verlangsamt - Eigenschaften, die bei der dreifach mutierten STAC3-Variante (ETLAAA) aufgehoben sind. Diese Ergebnisse etablieren STAC3 als multifunktionellen Regulator der Kalziumsignalisierung in der Skelettmuskulatur und liefern mechanistische Einblicke mit Relevanz sowohl für die normale Physiologie als auch für STAC3-assoziierte Myopathien.