Transport von extrazellulären Vesikeln über die BHS

Das Gehirn ist ein äußerst sensibles Organ, welches durch die sogenannte Blut-Hirn-Schranke (BHS) vor schädlichen Faktoren im Blutkreislauf geschützt wird. Die BHS sorgt außerdem für eine gleichmäßige und adäquate Versorgung der Gehirnzellen mit den benötigten Nährstoffen. Die Hauptkomponente der BHS in den meisten Wirbeltieren und im Menschen sind die sogenannten Gehirnendothelzellen, welche die Blutkapillaren im Gehirn innen auskleiden. Diese spezialisierte Zellschicht ist durch extrem dichte Zell-Zellverbindungen charakterisiert und reguliert strikt den Austausch von Ionen, Molekülen und Vesikeln zwischen dem Blutkreislauf und dem Gehirn beziehungsweise verhindert das Eindringen von Krankheitserregern und (Immun-)Zellen ins Gehirn. Die Kontrolle und Regulation dieser Transportmechanismen ist essentiell für die Funktion des Gehirns, Störung derselben können Auslöser oder Folge von weit verbreiteten Zivilisationskrankheiten wie Alzheimer und Schlaganfall sein. Die molekularen Mechanismen, welche Schlüsselmoleküle wie Glukose, Aminosäuren oder Transferrin durch die BHS transportieren, wurden in den letzten Jahrzehnten intensiv beforscht, auch um diese Transportwege für die Einschleusung von pharmazeutischen Wirkstoffen ins Gehirn zu nutzen. Dennoch gibt es bis dato nur wenige Pharmazeutika, die sich für die Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems eignen, vielfach weil potentielle Wirkstoffe nicht in ausreichender Menge durch die BHS an ihren Wirkort im Gehirn gelangen. Ein Transportweg, welcher noch sehr wenig erforscht wurde, betrifft den Durchtritt von extrazellulären Vesikeln (EV) durch die BHS. Es ist seit einigen Jahren evident, dass EV sowohl vom Gehirn in den Blutkreislauf übertreten können, als auch Vesikel, welche von Körperzellen produziert wurden, vom Blut ins Gehirn gelangen. Im vorliegenden Projekt werden wir durch eine Vielzahl unterschiedlicher experimenteller Ansätze die molekularen Mechanismen und die daran beteiligten zellulären Faktoren identifizieren, welche den Transport von Vesikeln durch die BHS ermöglichen. Unter anderem werden wir zu diesem Zweck ausgeklügelte in vitro Zellkultur Modelle der BHS basierend auf humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, hochauflösende Mikroskopietechniken und Proteomanalytik auf dem neuesten Stand der Wissenschaft und Technik verwenden. Um krankheitsrelevante Änderungen der Transportmechanismen der EV zu untersuchen, werden auch EV verwendet, die von ausgewählten Tumorzellen oder von Schlaganfallsmodellen stammen. Diese Daten werden das allgemeine Verständnis der Funktion der BHS erweitern, und können Relevanz für Erkrankungen des Gehirns, sowie für zukünftige Diagnose- und Therapiemöglichkeiten haben.

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist essenziell für die Funktion und Physiologie des Gehirns. Spezialisierte Endothelzellen regulieren den Transport von Nährstoffen, Stoffwechselprodukten und anderen Molekülen zwischen dem Blutstrom und den Zellen des Gehirns. Darüber hinaus stellt die BHS eine Schutzbarriere für das zentrale Nervensystem dar und verhindert, dass schädliche Substanzen oder Pathogene die empfindlichen neuronalen Zellen erreichen. Viele Zelltypen im menschlichen Körper setzen kleine Bläschen - sogenannte extrazelluläre Vesikel (EV) - frei, die bioaktive Moleküle zur zellulären Kommunikation enthalten. In mehreren Studien wurde vorgeschlagen, dass EV die BHS in beide Richtungen überwinden können, jedoch wurden bisher keine Details zu den zugrundeliegenden Mechanismen aufgedeckt. In dieser Studie wurden in-vitro Zellkulturmodelle der BHS verwendet, um die Anzahl an EV zu bestimmen, welche durch die BHS transportiert werden, und um potenzielle molekulare Wege zu identifizieren, die den Transport von EV vermitteln. In einer umfangreichen Serie von Experimenten - einschließlich systematischer Tests zahlreicher Parameter und Bedingungen sowie verschiedener BHS-Modellsysteme - blieb der Transport von EV über intakte BHS-Schichten unterhalb der Nachweisgrenzen der angewandten Techniken, obwohl die Aufnahme von EV durch Endothelzellen mittels verschiedener Methoden wie Durchflusszytometrie und hochauflösender Mikroskopie, bestätigt werden konnte. Die Aufnahme von EV konnte mit signalweg-spezifischen Inhibitoren blockiert werden, was zeigte, dass EV tatsächlich über spezifische molekulare Mechanismen von BHS-Zellen internalisiert werden, z. B. Makropinozytose und caveolae-vermittelte Endozytose. Zeitserien und Lebend-Zell-Mikroskopie zeigten, dass die große Mehrheit der internalisierten EV in lysosomalen Strukturen lokalisiert und von den Zellen vermutlich abgebaut wird. Ob die, von den EV transportieren Moleküle ebenfalls abgebaut, oder intrazellulär freigesetzt, umgepackt oder erneut ausgeschleust werden, ist derzeit noch unbekannt. Letztere könnten erklären, warum EV gebundene Moleküle aus dem Gehirn im peripheren Blut nachgewiesen werden konnten - und umgekehrt -, während der Durchtritt von intakten EV durch die BHS bislang nicht nachgewiesen wurde. Zusätzliche BHS-Modelle, die Endothelzellen des Gehirns mit Astrozyten kombinierten, wurden verwendet, um ischämische Schlaganfallbedingungen durch Hypoxie und Glukoseentzug zu simulieren. Unter solchen Stressbedingungen - die zu Genexpressionsveränderungen und einer erhöhten Durchlässigkeit der BHS führten - wurde eine erhöhte EV-Sekretion beobachtet, jedoch blieb ein Transport von Vesikeln über die BHS weiterhin nicht nachweisbar. Um weitere Einblicke in die molekulare Zusammensetzung einer ausgewählten Gruppe von Tumorzell-EV und potenzielle Interaktionspartner zu gewinnen, die die Aufnahme von EV durch Gehirnendothelzellen vermitteln könnten, wurde eine neue in-vitro-Biotinylierungstechnik etabliert. Massenspektrometrieanalysen identifizierten eine große Anzahl gemeinsamer und tumorspezifischer Proteine in EV, die Gegenstand weiterer Untersuchungen sind. Insgesamt konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass EV, die von verschiedenen Zelltypen freigesetzt werden, von Gehirnendothelzellen internalisiert werden können. Anstatt jedoch die Blut-Hirn-Schranke zu passieren, scheinen die meisten EVs im lysosomalen Abbauweg der Zellen degradiert zu werden.