DNA Reparatur in normalen und malignen B Zellen

Eine der Hauptursachen für Krebserkrankungen sind genetische Veränderungen in der DNA betroffener Zellen. Diese Veränderungen umfassen nicht nur einzelne DNA Basen, sondern auch die Neuanordnung langer DNA-Moleküle auf den Chromosomen, die dadurch zu einer veränderten Expression der Gene und somit zu einem unkontrollierten Zellwachstum beitragen können. Dabei ist die fortwährende Ansammlung genetischer Veränderungen nicht nur für die Krebsentstehung selbst, sondern vor allem für einen ungünstigen und rasch fortschreitenden Krankheitsverlauf sowie für Therapieresistenzen verantwortlich. Diese bewirken nämlich, dass aus einer Ansammlung genetisch unterschiedlicher Krebszellen die am besten angepassten Zellen selektiert werden. Eine wichtige Ursache für die Anhäufung genetischer Veränderungen ist eine fehlgeleitete DNA Reparatur. Da DNA Schäden in jeder Körperzelle laufend auftreten, ist die DNA Reparatur ein wichtiger Mechanismus um die DNA Schäden zu reparieren und somit die Ausprägung genetischer Veränderungen zu verhindern. Einer gesunden Zelle stehen mehrere Reparaturoptionen für beschädigte oder durchtrennte DNA Moleküle zur Verfügung. Dabei arbeiten die unterschiedlichen Reparaturwege jedoch mit unterschiedlicher Genauigkeit und Präzision. Ziel dieses Projekts ist es Faktoren herauszufinden, die bestimmen welcher DNA Reparaturweg von der Zelle eingeschlagen wird und warum Krebszellen diese Reparatur öfters fehleranfällig durchführen, was zur Anhäufung von genetischen Veränderungen führen kann. Als Modellsystem werden hierfür gesunde und leukämische B Zellen verwendet, da diese Zellen sehr leicht und in ausreichender Menge für funktionelle Versuche zur Verfügung stehen. Methodisch zeichnet sich das Projekt dadurch aus, dass sowohl genetische Tests durchgeführt werden als auch Genexpressionsprofile erstellt werden. Dadurch können in Kombination mitgeeigneten Reporter-Konstrukten aus gereinigten Zellen wichtige Reparaturfaktoren identifiziert werden. Diese neu entdeckten Faktoren werden in weiterer Folge in Zelllinien getestet, indem sie gezielt überexprimiert, verändert oder stillgelegt werden. Ein besseres Verständnis der DNA Reparatur und dessen Regulation, sowie der häufig auftretenden InstabilitätdesGenoms vonKrebszellen kannentscheidend bei Behandlungsmöglichkeiten von Krebs helfen.

Eines der Hauptmerkmale von Krebserkrankungen ist die Ausprägung von Mutationen und strukturellen chromosomalen Veränderungen wie zum Beispiel Translokationen oder Deletionen. All diese genetischen Veränderungen tragen nicht nur fundamental zur Krebsentstehung bei, sondern spielen eine wichtige Rolle bei der Ausprägung von Therapieresistenzen. Bei der Ausprägung dieser genomischen Veränderungen spielen verschiedene DNA Reparaturmechanismen eine entscheidende Rolle, die einerseits genomische Veränderungen begünstigen oder auch verhindern können. Daher ist es von entscheidender Bedeutung diese Reparaturmechanismen besser zu verstehen um zukünftig möglicherweise gezielte Eingriffe in diese Mechanismen therapeutisch nutzbar zu machen. In diesem Forschungsprojekt haben wir uns mit der Untersuchung von DNA Reparaturmechanismen in Zusammenhang mit Krebserkrankungen vor allem auch in Hinblick auf B Zell Leukämien beschäftigt. Dafür haben wir einerseits DNA Mutations- und Expressionsprofile aus Datenbanken analysiert als auch Laborexperimente durchgeführt. Aus unseren Untersuchungen konnten wir den Einfluss eines bestimmten genetischen Profils auf die Ausprägung und Ansammlung von somatischen Mutationen in Krebszellen verschiedenster Entitäten nachweisen. Dabei konnten wir unter anderem neue Einblicke in die Ausprägung von templated sequence insertions (TSIs) gewinnen. TSIs sind DNA-Insertionen, die eine hohe Homologie zu entfernten genomischen oder extrachromosomalen Regionen aufweisen. Der Einbau solcher Sequenzen tritt regelmäßig in Krebsgenomen auf und wir konnten zeigen, dass diese sowohl durch einen bestimmten DNA-Reparaturfaktor in Kombination mit dem NHEJ-Reparaturweg (non-homologous end joining) als auch durch die Struktur der zu reparierenden DNA-Enden reguliert werden. Dieser Reparaturweg beeinflusst ebenso die Ausprägung von kurzen Duplikationen und Inversionen von DNA Stücken nahe einer Reparaturstelle von DNA Doppelstrangbrüchen. Um die gesamte Komplexität dieser strukturellen Veränderungen auf genomweiter Ebene in Zellen zu untersuchen, entwickelten wir im Rahmen dieses Forschungsprojekts eine Methode die auf gezielte endonukleolytische DNA Brüche und Hochdurchsatz DNA Sequenzierung basiert. Mit diesem Ansatz können Translokationen, Insertionen/Deletionen (Indels) sowie TSIs oder andere Veränderungen in Abhängigkeit einzelner genetischer Faktoren systematisch untersucht werden. Schließlich erlaubte die Forschungsförderung auch die eingehende Untersuchung der Stabilität eines Reparaturenzyms, welches für die Entfernung von deaminierten DNA Basen (Cytosin zu Uracil Veränderungen; C>U) verantwortlich ist. Dieses Enzym spielt bei gesunden B Lymphozyten während der Differenzierung zu Antikörper-produzierenden Immunzellen eine wichtige Rolle und reguliert die Ausprägung von Mutationsmustern an Cytosinen in gesunden und malignen Zellen. Dabei untersuchten wir verschiedene Proteine, die für diese Reparaturabläufe in den Zellen entscheidend sind, um zu verstehen, wie Cytosin-Deaminierungen fehlerfrei repariert werden oder zu Mutationen führen. Da Nukleinsäure-Deaminierungen nicht nur bei DNA-Veränderungen sondern auch beim RNA-editing eine Rolle spielen, konnten durch dieses Projekt zusätzlich neue Daten zum C>U editing in gesunden und malignen B Lymphozyten gewonnen werden. Zusammenfassend lieferten die aus dem Projekt gewonnenen Ergebnisse wichtige Einblicke in die Reparatur der DNA, die Ausprägung von chromosomalen Veränderungen und mögliche Ansatzpunkte für zukünftige Therapien gegen Krebs.