Biochemische Untersuchung zur tRNA Fragment-Entstehung

Transfer RNAs (tRNAs) sind unverzichtbar für die Produktion von Eiweißstoffen aus Boten- RNA. Spezifische Umweltbelastungen induzieren die Fragmentierung zellulärer RNAs, einschließlich der tRNAs, welche normalerweise als Adaptermoleküle in der Proteinsynthese fungieren. Bei der tRNA-Fragmentierung entstehen sogenannte tRNA-Fragmente, die scheinbar funktionelle kleine RNAs sind und über weitgehend unbekannte molekulare Mechanismen auf Zellen einwirken. Verschiedene tRNA-Fragmente wurden wiederholt bei zellulären Reaktionen auf Stress wie Hunger, Oxidation, Sauerstoffunterversorgung, Unterkühlung als auch Hitzeschock oder Bestrahlung nachgewiesen. Wichtig ist auch, dass spezifische tRNA-Fragmente an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind, darunter Zellteilung und Differenzierung, Proteinsynthese, Kontrolle von mobilen Elementen, interzellulärer Kommunikation und der Übertragung von nicht-genetischer Information zwischen Generationen. Es wird allgemein angenommen, dass tRNA-Fragmente durch die Aktivität von Enzymen produziert werden, die Brüche in tRNAs einführen. Ein einzelner Bruch in einer tRNA sollte zu zwei tRNA-Fragmenten führen, die als tRNA-Hälften bezeichnet werden. Interessanterweise behalten Zellen, die sich von Stress erholen, nur eine tRNA-Hälfte, was auf das Vorhandensein von zellulären Aktivitäten hinweist, die die andere tRNA-Hälfte abbauen. Dieses Projekt wird die enzymatischen Aktivitäten identifizieren, die tRNAs weiterverarbeiten, welche während der Stressreaktion menschlicher Zellen gebrochen wurden. Konkret zielt das Projekt darauf ab, Enzyme zu identifizieren, die nur eine tRNA- Hälfte abbauen, während die andere intakt bleibt. Dazu wird ein biochemischer Ansatz in Kombination mit experimentelle Stressbedingungen an menschlichen Zellkultursystemen eingesetzt werden. Nach der Identifizierung werden die molekularen Details, die solche tRNA- spezifischen Aktivitäten definieren, unter Verwendung rekombinanter Protein- und RNA- Ansätze bestimmt werden. Angesichts des Nachweises von tRNA-Fragmenten in vielen Zelltypen und Arten, ihrer funktionellen Assoziation mit spezifischen zellulären Prozessen und ihres Potenzials, als Biomarker für bestimmte menschliche Krankheiten zu dienen, wird die Identifizierung der molekularen Maschinerie, die an der Produktion von tRNA-Fragmenten beteiligt ist, unser Verständnis erweitern, wie diese kleinen RNAs biologische Wirkung ausüben. Darüber hinaus wird die Identifizierung von spezifischen Aktivitäten, die die Produktion und damit wahrscheinlich auch die Funktion von tRNA-Fragmenten beeinflussen, wichtige Erkenntnisse liefern, die sowohl diagnostische als auch therapeutische Relevanz für die Verwendung dieser kleinen RNAs haben können.

Transfer-RNAs (tRNAs) sind für das Lesen von mRNAs und deren Translation in Proteinsequenzen unerlässlich. Insbesondere während der zellulären Stressantwort können tRNAs zu Substraten spezifischer Enzyme werden, was zu einem Bruch des tRNA-Rückgrats an definierten Stellen führt. Die Produkte einer solchen tRNA-Spaltung werden als tRNA-abgeleitete RNAs (tDRs) bezeichnet. Da tDRs mit spezifischen molekularen Signalwegen und Krankheiten in Verbindung gebracht werden, besteht großes Interesse an ihrer biologischen Funktion sowie ihrem Potenzial als Biomarker für Gewebeschäden und zellulären Stress. Lange Zeit bestand jedoch eine erhebliche Wissenslücke hinsichtlich der Entstehung dieser tDRs. Weil tRNAs hochstrukturierte Moleküle sind, war unklar, wie die Hydrolyse einer einzigen Phosphodiesterbindung - die zu sogenannten "gebrochenen" (an einer Stelle gespaltenen) tRNAs führt - ausreichen konnte, um einzelne, biologisch aktive tDRs zu erzeugen. Zeitgleich mit Beginn dieses Projekts hatten wir bereits spezifische humane RNA-Helikasen identifiziert, die in der Lage sind, "gebrochene" tRNAs zu trennen. Diese Entdeckung bildete die Grundlage für die molekulare Analyse der tDR-Biogenese, insbesondere im Hinblick auf das Phänomen der tDR-Asymmetrie - also der ungleichen Produktion von 5- und 3-tDRs aus derselben tRNA. Hierfür wurden biochemische Verfahren eingesetzt, bei denen das zelluläre Proteom von humanen Zellen systematisch fraktioniert und dann mittels In-vitro-Tests auf Aktivitäten untersucht wurde, um 3-tDR-abbauende Proteine zu finden. Parallel dazu wurden durch Immunpräzipitation und Massenspektrometrie RNasen identifiziert, die mit der Nuklease Angiogenin (dem Hauptenzym für die spezifische Spaltung von tRNAs im Antikodon) während der Stressantwort interagieren. Diese Ansätze führten zur Identifizierung mehrerer RNasen, die stress-induzierte 3-tDRs prozessieren können. Insbesondere zeigten Komponenten des RNA-Exosoms eine physikalische Assoziation mit "gebrochenen" tRNAs und wiesen in vitro Ribonuklease-Aktivität gegenüber 3'tDRs auf. Die Ergebnisse dieser Experimente werden derzeit validiert und durch Untersuchungen zur Beeinflussung der in-vivo-Funktion der identifizierten RNasen weiter vertieft. Zusammengefasst deuten die Ergebnisse dieses Projekts darauf hin, dass in menschlichen Zellen nach einer anfänglichen stress-induzierten tRNA-Fragmentierung, die "gebrochenen" tRNAs nicht nur durch spezifische RNA-Helikasen in 5' und 3' tDRs getrennt werden, gefolgt vom Abbau von 3'tDRs, was nahelegt, dass 5' tDRs für eine potenzielle biologische Aktivität selektiv erhalten werden.