Regulation von Ca-Strömen und ECC durch Spannungssensoren

Spannungs-aktivierte Kalziumkanäle steuern eine Vielzahl wichtiger Funktionen von erregbaren Zellen, wie die Muskelkontraktion, die Sekretion von Hormonen und Neurotransmittern, und die Aktivitäts- gesteuerte Genregulation. Um einen Kalziumeinstrom in die Zelle zu aktivieren besitzen diese Kanäle vier Spannungssensoren, welche symmetrisch um eine gemeinsame Kanalpore angeordnet sind. In Säugetieren unterscheiden sich diese vier Spannungssensoren voneinander strukturell und funktionell. Im Skelettmuskel Kalziumkanal steuern die vier Spannungssensoren zwei separate Funktionen; den Einstrom von Kalzium durch die Kanalpore, sowie die Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern, auch Erregungs-Kontraktions-Kopplung genannt. Welche der vier Spannungssensoren welche dieser beiden Funktionen regulieren und welche Mechanismen deren unterschiedliche Aktivierungseigenschaften bestimmen, ist nicht bekannt. Die hier gelplanten Experimente sollen erklären, wie die vier Spannungssensoren zusammenwirken, um das Öffnen und Schließen des Kanals zu regulieren. Und weiters, wie der Skelettmuskelkanal gleichzeitig zwei verschiedene Funktionen, Kalziumeinstrom und Muskelkontraktion, bei unterschiedlichen Membranspannungen und mit unterschiedlicher Geschwindigkeit aktivieren kann. Die zugrundeliegende Hypothese besagt, dass Spannungssensoren I und IV die Kanalöffnung regulieren, und Spannungssensor II und/oder III die Muskelkontraktion, und dass auf molekularer Ebene spezifische Ionenbindungen zwischen gegensätzlich geladenen Aminosäuren die spezifischen Aktivierungseigenschaften der vier Spannungssensoren bedingen. Diese Fragen werden mit drei, einander ergänzenden methodischen Ansätzen untersucht: (1) Gezielte Mutationen der Spannungssensoren basierend auf Vorhersagen unserer Strukturmodelle. (2) Computer-basierte Molekulare Dynamik Simulationen der Struktur des Kanals in unterschiedlichen Aktivitätszuständen. (3) Hochauflösende funktionelle und strukturelle Analysen von Kanal-Chimären, bestehend aus einem bakteriellen Kanal mit Spannungssensoren von Säuger-Kanälen. Diese Struktur-Funktions-Untersuchungen befassen sich mit wesentlichen Fragen zum biophysikalischen Mechanismus von Spannungssensoren und der Funktion von Ionenkanälen, sowie dem Mechanismus der Erregungs-Kontraktions-Kopplung. Unter anderem zielen die geplanten Arbeiten darauf ab, das erste dynamische Computer-Strukturmodell von Säuger-Kalziumkanälen zu generieren und einen synthetischen Kanal herzustellen, der es erlaubt einzelne Spannungssensoren in noch nicht dagewesener Auflösung zu untersuchen.

Regulation von Kalzium-Strömen und Erregungs-Kontraktions-Kopplung durch Spannungssensoren Im vorliegenden FWF Projekt haben die Innsbrucker Physiologen um Prof. Bernhard Flucher einen wesentlichen Mechanismus entschlüsselt, mit dem die Kontraktion unserer willkürlichen Muskeln gesteuert wird. Die Kontraktion unserer Skelettmuskeln wird willkürlich durch das motorische Nervensystem aktiviert. Dabei erreicht ein elektrisches Signal den Muskel. In der Muskelzelle führt daraufhin die rasche Änderung der Konzentration von Kalzium Ionen zur Kontraktion. Wie höher die Kalziumkonzentration, desto stärker die Muskelkontraktion. Wie wird nun das elektrische Signal an der Zelloberfläche in den Anstieg der Kalziumkonzentration im Zellinneren übertragen? Obwohl mittlerweile alle wesentlich daran beteiligten Moleküle bekannt sind, ist der Mechanismus dieser Signalübertragung - genannt elektro-mechanische Kopplung oder Erregungs-Kontraktions-Kopplung - nach wie vor nicht entschlüsselt. Die Spannungsänderung an der Zellmembran wird durch einen Spannungs-aktiven Kalziumkanal wahrgenommen, dessen Aktivierung die Kontraktion einleitet. Im Herzmuskel und in den glatten Muskeln innerer Organe führt die Aktivierung des Kalziumkanals zum öffnen seiner Kanalpore und damit zum Einstrom von Kalzium aus dem Extrazellularraum. Nicht aber im Skelettmuskel, in dem das gesamte, für die Kontraktion notwendige Kalzium aus inneren Speichern freigesetzt wird. Hier aktiviert der Kalziumkanal die Öffnung eines Kalzium-Freisetzungskanal im inneren der Muskelzelle. Somit fungiert der Spannung-aktivierte Kalziumkanal lediglich als Spannungssensor. Aus der Proteinstruktur des Kalziumkanals wissen wir, dass dieses modular aufgebaute Membranprotein insgesamt vier Spannungssensoren besitzt, die um eine gemeinsame Kanalpore angeordnet sind. Nicht bekannt war bislang, ob diese alle an der Aktivierung der Kontraktion beteiligt sind. Für eine Aufgabenteilung unter den vier Spannungssensoren sprich, dass die Muskelkontraktion sehr rasch bei geringen Spannungsänderungen aktiviert wird, während die Öffnung der Kanalpore langsam und erst bei wesentlich höheren Spannungsänderungen eintritt. Im vorliegenden Projekt, kombinierten die Innsbrucker Forscher modernste molekulargenetische, mikroskopische und eletrophysiologische Methoden mit Computerunterstützter Strukturanalyse um diese Frage zu beantworten. Die Forschungsergebnisse zeigen eindeutig, dass ein einziger schnell und empfindlich reagierender Spannungssensoren für die Steuerung der Kontraktion verantwortlich ist. Dagegen sind alle vier Spannungssensoren zur Öffnung der Kanalpore nötig und die Geschwindigkeit und Empfindlichkeit dieses Prozesses werden durch jeweils einen langsamen und einen relativ unempfindlichen Spannungssensor limitiert. Diese neuen Erkenntnisse stellen einen wichtigen Fortschritt in der Muskelphysiologie dar und eröffnen faszinierende Einblicke in die Struktur und Funktionsweise einer wichtigen Gruppe von Proteinen, den Spannungs-aktivierten Kalziumkanälen.