Biosynthese der Phosphatidsäure in der Hefe

In Eukaryonten gibt es zwei nach ihren Ausgangssubstraten benannte Wege der de-novo-Synthese von Phosphatidsäure (PtdOH): a) den Glycerin-3-phosphat- (Gro3P), und b) den Dihydroxyacetonphosphat- -(GrnP) Weg. Die Umsetzung -von Gro3P zu PtdOH wird von zwei Acyltransferasen katalysiert, während an der PtdOH Biosynthese über den GMP Weg noch ein weiteres Enzym beteiligt ist, welches das Zwischenprodukt 1 -Acyl- GrnP zu 1 -Acyl-Gro3P reduziert. In allen eukaryotischen Zellen kommen Enzyme, die an der Bildung von PtdOH beteiligt sind, in mehrfacher Ausführung vor. Dies gilt auch für die Hefe Saccharomyces cerevisiae, welche als Modell für das hier vorgestellte Projekt dienen wird. Bis jetzt konnten in der Hefe nur zwei Enzyme, die an dem Prozeß der PtdOH Bildung beteiligt sind, auf molekularer Ebene identifiziert werden. Das Ziel dieses Projektes ist die Identifizierung und Charakterisierung weiterer an diesem Vorgang beteiligten Hefegene und Genprodukte, sowie deren Lokalisierung in der Zelle. Diese Studie soll dazu dienen, das Wechselspiel der Organellen bei der PtdOH Synthese, den Grund für die Redundanz, und die Kompatibilität der Isoenzyme zu klären. Bioinformatik, molekularbiologische, zellbiologische und biochemische Methoden werden zur Identifizierung der an diesem Vorgang beteiligten Enzyme herangezogen. Für die Untersuchung der subzellulären Verteilung der Proteine werden fluoreszenz-mikroskopische Methoden (Markierung mit einem grün fluoreszierendem Protein, immunologische Methoden) und Zellfraktionierungen (Western Blot Analysen und enzymatische Messungen) eingesetzt. Der Vergleich der gebildeten PtdOH-Spezies in Wildtypzellen mit jenen in verschiedenen Deletionsmutanten, die während des Projektes hergestellt werden, wird den Beitrag der einzelnen Isoenzyme zur PtdOH Synthese zeigen. Weiters wird diese Studie auch zur Klärung der Frage dienen, ob verschiedene PtdOH "Pools", möglicherweise in verschiedenen Zellkompartimenten, existieren und welchen Beitrag diese zur Gesamtsynthese der Glycerophospholipide und Triacylglycerole leisten. Zusammenfassend soll diese Studie dazu beitragen, die zellbiologische Rolle der PtdOH in der Hefe besser zu verstehen, wobei dieses Wissen auch dazu beitragen wird, die Bedeutung dieses wichtigen Intermediats für die Glycerolipidsynthese in höheren eukaryotischen Systemen zu klären.

In Eukaryonten gibt es zwei nach ihren Ausgangssubstraten benannte Wege der de-novo-Synthese von Phosphatidsäure (PtdOH): a) den Glycerin-3-phosphat- (Gro3P), und b) den Dihydroxyacetonphosphat- (GrnP) Weg. Zwei Acyltransferasen, Gat1p und Gat2p, katalysieren den ersten Acylierungsschritt des Gro3P Weges in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Während meines Firnbergprojekts wurde die subzelluläre Lokalisierung von Gat1p und Gat2p der Hefe durch a) enzymatische Messungen an isolierten Zellorganellen, b) Fusion mit GFP (green fluorescent protein) und Fluoreszenzmikroskopie der transformierten Hefezellen, und c) mittels Western Blot Analyse bestimmt. Gat1p befindet sich auf Lipidpartikeln und im Endoplasmatischen Reticulum (ER), während Gat2p nur im ER lokalisiert ist. Experimente aus früheren Arbeiten deuteten darauf hin, daß zumindest eine weitere Acyltransferase in der Hefe existiert. Da eine gat1 gat2 Mutante nicht lebensfähig ist muß man annehmen, daß ein derartiges weiteres Enzym nicht in der Lage ist, den Defekt von Gat1p und Gat2p zu komplementieren. Weitere molekularbiologische Screenings werden notwendig sein, um diese Frage eindeutig beantworten zu können. Neben Acyltransferasen enthalten Lipidpartikel der Hefe eine Reihe anderer Enzyme, die am Lipidmetabolismus beteiligt sind. Unter diesen Proteinen befindet sich eine Triacylglycerin Lipase. Dies ist das erste Enzym dieser Art, das in der Hefe identifiziert werden konnte. Außerdem sind Enzyme des Sterolmetabolismus, z.B. Erg7p, in Lipidpartikeln der Hefe lokalisiert. Durch Lokalisierung von Erg11p (katalysiert den Reaktionsschritt nach Erg7p in der Sterolbiosynthese) und Erg27p (vermutlich ein Regulator für die Lokalisierung von Erg7p) im ER, konnte eine Wechselbeziehung von Lipidpartikeln mit dem ER bei der Sterolsynthese in Hefe nachgewiesen werden. Die letztgenannten Studien wurden in Zusammenarbeit mit Dr. G. Balliano (Turin, Italien) und Dr. M. Bard (Indianapolis, USA) durchgeführt.