Untersuchungen zur Regulation des Herz-Na+Kanals durch PKA

Spannungsabhängige Natriumkanäle sind verantwortlich für die Regeneration von Aktionspotentialen in elektrisch erregbaren Zellen sowie deren Leitfähigkeit. Die Perfusion von Xenopus laevis oocyten, die den beta2-adrenergen Rezeptor und die kardiale alpha-Untereinheit des Natriumkanals der Ratte (SkM2) oder des Menschen (hH1) coexpremieren, mit Isoproterenol führt zu einer signifikanten Zunahme des Natrium Spitzenstroms. Durch die intrazelluläre Injektion von cAMP und der katalytischen Untereinheit von PKA konnte dieser Effekt reproduziert werden, wodurch auf die Beteiligung einer Modulation durch PKA geschlossen werden konnte. Die Mutation der fünf potentiellen Consensus-Stellen für eine Phosphorylierung durch PKA hatte keinen Einfluß auf den beobachteten Effekt. Die Untersuchungen von Chimären Kanälen bestehend aus Teilen des humanen, kardialen Kanals (hH1) und des Skelettmuskel Natriumkanals der Ratte (SkM1, ist nicht durch PKA reguliert) ergaben, daß die cytoplasmatische Schleife zwischen Domäne I und II für die Ausübung des Effekts durch PKA verantwortlich ist. Demzufolge liegt das Ziel dieser Arbeit in der Erforschung und Charakterisierung des Mechanismus über den der kardiale Natriumkanal durch PKA reguliert wird. In-vitro -und in-vivo Phosphorylierungsexperimente sollen Aufschluß über eine direkte Beteiligung des Kanalproteins an der Phosphoregulation geben, bzw. soll mit Hilfe der Herstellung von Deletionsmutanten und der Einführung von Punktmutationen der Ort der PKA-Regulation identifiziert werden. Experimente zur Protein:Protein Interaktion zwischen dem Kanalprotein und cytosolischen Proteinen sollen eine Identifikation von Proteinen ermöglichen, die an der Regulation über PKA beteiligt sein könnten. Verschiedene Studien zeigten, das die Aktivierung von PKA nicht nur die Funktion des Kanals beeinflußt, sondern auch den Transport und den Einbau des Kanalproteins in die Membran reguliert. Die Herstellung von GFP- Fusionsproteinen soll eine direkte Beobachtung des sogenannten "membrane-traffickings" von Kanalproteinen in Xenopus laevis oocyten, sowie in HEK Zellen ermöglichen. Ebenso sollen die Transport-Charakteristika unter dem Einfluß von PKA und/oder Substanzen die das Recycling der Proteine der Plasmamembrane hemmen untersucht werden. Ergebnisse dieser Studien werden einen besseren Einblick in die Regulation von Ionenkanälen liefern und durch die Identifizierung weiterer regulatorischer Proteine dieser Signaltransduktions-Kaskade die Manigfaltigkeit der Regulation durch PKA genauer beleuchten.