RNA Chaperone Aktivität von ribosomalem Protein L1

Das Ribosom ist eine komplexe molekulare Maschine bestehend aus dem ribosomalen RNA Gerüst und ribosomalen Proteinen, die in dieses Gerüst hineinmodelliert sind. Das Escherichia coli Ribosom besteht aus 2 asymmetrischen Untereinheiten, der kleinen oder 30S Untereinheit, die wiederum aus der 16S rNA und 21 Proteinen besteht und aus der großen oder 50S Untereinheit bestehend aus 2 RNA Molekülen (23S, 5S) und 34 Proteinen. Kürzlich wurde gezeigt, daß ein Drittel der Proteine der 50S Untereinheit RNA Chaperone Aktivität in vitro haben (Semrad et al., 2004). RNA Chaperones sind Proteine, die entweder verhindern, daß sich RNA falsch faltet oder, die falsch gefaltete RNA wieder richtig falten ohne dabei ATP zu hydrolysieren. In dieser Studie wird getestet werden, ob diese RNA Chaperone Aktivität der ribosomalen Proteine auch bei anderen Organismen konserviert vorliegt. Ribosomales Protein L1 von E.coli, das sehr hohe Aktivität gezeigt hat, hat viele Homologe in anderen Organismen. Deshalb werden verschiedene L1 kloniert und aufgereinigt und anschließend in unseren RNA Chaperone Aktivitäts Assays getestet. Falschfaltung von RNA ist hauptsächlich ein Problem in der Kälte. Die Hypothese ist deshalb, daß RNA Chaperones wahrscheinlich höhere Aktivität bei niedrigen Temperaturen zeigen werden. Deshalb werden L1 von psychrophilen, mesophilen aber auch von thermophilen Organismen ausgewählt werden um zu testen, ob unterschiedleiche Aktivitäten mit Wachstumsbedingungen korrelieren. Anschließend werden von den getesteten Proteinen Sequenzalignments gemacht um mögliche Unterschiede herauszuarbeiten, die mit Chaperone Aktivität korrelieren könnten. Schlußendlich wird getestet werden, ob diese RNA Chaperone Aktivität auch während der Translation benötigt wird: das ribosomale Protein L1 sitzt an der E (Exit) Stelle im Ribosom, und es wurde vorgeschlagen, daß L1 eine funktionelle Rolle beim Verlassen des Ribosoms von der tRNA in der E-site spielen könnte. Diese Hypothese wird in vivo und in vitro getestet werden. In vivo wurde es bereits gezeigt, daß ein Fehlen von L1 zwar nicht lethal ist, aber die Wachstumsrate halbiert (Baier et al. 1990). In diesem Projekt wird E.coli L1 in vivo durch ein jeweiliges L1 Homolog ersetzt werden und die Wachstumsraten werden bestimmt werden einerseits bei 37C, aber auch bei niedrigeren Temperaturen. Für den in vitro Teil des Projektes werde ich ein in vitro Translationssystem etablieren, mit dem das Verlassen der E-site tRNA von 70S Ribosomen, bei denen entweder L1 fehlt oder durch ein L1 Homolog ersetzt worden ist, gemessen wird.