Struktur-Funktions-Analyse des Mpa-Komplexes aus dem bakteriellen Proteasom

Energieabhängiger Proteinabbau stellt eine essenzielle Aktivität der Zelle dar. In Eukaryoten ist das 26S-Proteasom für den Großteil des zellulären Proteinumsatzes verantwortlich, indem es Proteine, die zuvor mit Ubiquitin markiert wurden, abbaut. Bakterienzellen enthalten eine Reihe von Proteinabbaukomplexen, die zwar in ihrer generellen Architektur dem 26S-Proteasom ähneln, aber dennoch große Unterschiede bezüglich der Funktionsweise und der Aktivität aufweisen. Einzig die Untergruppe der Aktinobakterien, einschließlich des Tuberkulose-Erregers Mycobacterium tuberculosis, bildet eine Ausnahme, indem diese Bakterien ein Proteasom aufweisen. Der katalytisch aktive Proteasomkern (20S-Proteasom) ist hier an einen ringförmigen ATPase-Komplex namens Mpa gebunden. Proteine, die zur Proteolyse bestimmt sind, werden hier durch ein kleines Protein namens Pup markiert, das kovalent an die Seitenkette von Lysin-Gruppen im Substrat bindet und damit an Ubiquitinierung in eukaryotischen Organismen erinnert. Bedeutend ist die Tatsache, dass gezeigt werden konnte, dass der Tuberkulose-Erreger Mycobacterium tuberculosis in seiner Überlebensfähigkeit in der Lunge eingeschränkt ist, wenn Teile des Proteasom- und Pup-abhängigen Proteinabbaus ausgeschaltet werden. Infolgedessen wird diesem Stoffwechselweg großes Potential in der Entwicklung neuartiger Anti-Tuberkulose-Medikamente zugeschrieben. Ziel des vorliegenden Projekts ist eine detailierte Untersuchung der Proteinentfaltungs- bzw. Proteinabbauaktivität der bakteriellen Unfoldase Mpa alleine und im Komplex mit dem 20S-Proteasom. Um molekulare Einblicke in den Mpa-Proteasom-Komplex zu erhalten, werden wir eine kombinierte Strategie bestehend aus Molekularbiologie, Proteinbiochemie, Biophysik, Proteinkristallographie und Elektronenmikroskopie anwenden. Strukturelle Daten werden den Grundstein dafür legen, ein Modell der Entfaltungs- und Abbaureaktion zu entwickeln, dessen Relevanz anschließend in vitro getestet werden wird. Zusätzlich wird eine detaillierte biochemische Analyse des Mechanismus der Proteinentfaltung durch Mpa erfolgen, sowohl für den isolierten Mpa-Ring als auch im Komplex mit dem 20S-Proteasom. Durch die ausgeprägte Sequenzhomologie von Mpa sowohl zu Untereinheiten des eukaryotischen 19S-Proteasom-Subkomplexes als auch zu Proteasom-aktivierenden Nukleotidasen aus Archaebakterien (PAN) sind wir überzeugt, dass die Struktur-Funktions-Analyse von Mpa auch Aufschluß geben wird über den generellen Mechanismus ATP-abhängiger, Proteasom-assoziierter Unfoldasen. Das vorgelegte Projekt zielt auf ein detailliertes Verständnis der bakteriellen Unfoldase Mpa und ihrer Kollaboration mit dem 20S-Proteasom ab. Wir sind überzeugt, mit den vorgeschlagenen Struktur-Funktions- Studien die Basis für eine mechanistische Aufklärung der Entfaltungs- und Abbaureaktion im Mpa-Proteasom- Komplex und deren physiologische Relevanz legen zu können.

Das vorliegende Projekt hatte die strukturelle und biochemische Untersuchung des Proteasom-Komplexes aus Mycobakterien zum Ziel. Das Proteasom ist ein grosser Proteinkomplex, der in fast allen Lebewesen vorhanden und von zentraler Bedeutung für den gezielten Abbau von Proteinen ist. Das Proteasom aus höheren Organismen als solches und sein Aufbau und seine Funktion sind seit langer Zeit bekannt und verstanden. Die Tatsache, dass auch niedrige Organismen der Gattung Mycobakterien (einschließlich des Krankheitserregers Mycobacterium tuberculosis) einen Proteasom-Komplex zum Abbau von Proteinen besitzen, ist allerdings erst seit recht kurzer Zeit bekannt.Es wurde davon ausgegangen, dass das mycobakterielle Proteasom aus zwei verschiedenen Bestandteilen besteht: zum einen aus Mpa, das die Substratproteine erkennt und auswählt und in einem zweiten Schritt ATP-abhängig entfaltet und in die Protease transportiert; der andere Teil besteht aus dem 20S-Proteasom, der eigentlichen Protease, das die Substratproteine schließlich zu kurzen Peptiden abbaut. In Analogie zum eukaryotischen Proteasom wurde vermutet, dass die Bindung von Mpa an das Kern-Proteasom durch den C-terminalen Rest von Mpa gesteuert wird, obwohl sich die Sequenz deutlich von anderen Proteasom-bindenen Proteinen unterscheidet.Die vorliegende Studie hat sich mit diesem Zusammenspiel zwischen Mpa und dem Proteasom beschäftigt. Wir konnten zeigen, dass sowohl Mpa als auch das Proteasom die zu erwartenden katalytischen Aktivitäten besitzen. Die Bildung eines aktiven Mpa-Proteasom-Komplexes mit der Fähigkeit, ein Substrat sowohl zu erkennen als auch abzubauen, wurde allerdings nicht beobachtet. Sogar wenn der C-terminale Rest von Mpa so verändert wurde, dass er bekannten Proteasom-bindenden Proteinen entspricht, konnten Proteasom und Mpa nicht kooperieren, woraus wir schließen, dass der Mechanismus, mit dem Mpa ans Proteasom bindet, sich entweder deutlich von dem des eukaryotischen Proteasoms unterscheidet, oder eine intitiale Aktivierung erfolgen muss, um so eine Bindung zu ermöglichen. In diesem Zusammenhang konnten wir zeigen, dass Mpa und CP nach Zugabe von Zellextrakt sehr wohl einen funktionierenden Komplex bilden und die Gesamtaktivität wiederhergestellt werden kann. Diese Resultate weisen tatsächlich auf zusätzliche, allerdings noch zu identifizierende Komponenten des mycobakteriellen Proteasoms hin.Schließlich stellt die Erkenntnis, dass das Proteasom aus Mycobakterien dem von höheren Organismen weit weniger ähnlich ist als ursprünglich angenommen, eine interessante Möglichkeit für zukünftige Forschung zu Tuberkulose-Therapien dar.