Etablierung eines umfassenden Pathogen-Proteinarrays

Staphylococcus aureus ist ein bedeutendes Pathogen, welches zunehmend Resistenzen gegenüber herkömmlichen Antibiotika zeigt. Deshalb besteht nicht nur der dringende Bedarf, die zugrunde liegende Physiologie im Detail zu charakterisieren. Auch die kontinuierliche Weiterentwicklung und Verschmelzung experimenteller Hochdurchsatztechnologien zur Generierung innovativer Behandlungs- als auch Therapieansätzen soll gefördert werden. Ausgehend von unserer eigenen bereits vorhandenen Genom-weiten Kollektion vollständiger S. aureus Gene beabsichtigen wir in diesem Zusammenhang, ein systematisches S. aureus Expressions-ORFeome` zu klonieren. Dieses wird aus 2562 sequenzierten, GST-getaggten Genen bestehen. Diese wertvolle Ressource stellt die Ausgangsbasis für die nachfolgend geplante Produktion eines proteomweiten S. aureus Proteinchips dar. Obwohl Proteinchips als Platform zur Bemessung biochemischer Aktivitäten bzw. Bindungsspezifitäten bereits anerkannt sind, haben zahlreiche praktische bzw. technische Herausforderungen in Bezug auf Chipproduktion und limitierten Inhalt bislang jedoch deren universelle Anwendung behindert. Im Gegensatz zu gängigen Technologien kombiniert unser mittlerweile weitgehend optimisiertes shotgun Format das Spotten transformierter E. coli Klone, die induzierte Proteinexpression, die Suche nach Interaktoren sowie letzlich die Detektion auf einer einzigen Nitrocellulosemembran. Durch Verwendung einer Mixtur aus vier verschiedenen E. coli Stämmen - jeder davon mit seinen eigens ausgewählten Vorteilen -, sollte die Ausbildung sogenannter inclusion bodies, die bekanntlich in denaturierten Proteinen resultieren, weitgehend umgangen werden. Eine unfokussierte Durchmusterung solch umfassender Proteinkollektionen kann somit viele unerwartete Assoziationen aufzeigen, die in einem eingeschränkteren Design verfehlt würden. Weiteres wesentliches Ziel unserer Applikation ist es dennoch, einen echten, jedoch fokussierten Proteinchip zu fabrizieren. Letzterer soll aus 351 rekombinant exprimierten und nativ aufgereinigten Genprodukten bestehen, die alle aufgrund ihrer essentiellen Rolle in S. aureus Wachstum und Überleben ausgewählt wurden. Aufgrund intern inkludierter Kontrollen ermöglichen beide Arten von Proteinchips - trotz offensichtlicher Unterschiede in Komposition und Qualität - eine relativ einfache Standardisierung, Signal-zu- Hintergrund Quantifizierung, Qualitätsbeurteilung sowie Inter-Blot Normalisierung digitalisierter Ergebnisse. Gemäß unseren Erwartungen sollen beide Produkte nicht nur eine wichtige Rolle in grundlegender S. aureus Forschung zur Aufklärung molekularer Subnetzwerke spielen, sondern auch in der Entdeckung diagnostischer Marker, Impfstoffkandidaten und neuer Therapeutika.

S. aureus stellt ein gram-positives Bakterium dar, das bei einem signifikanten Anteil der Bevölkerung temporär oder persistent in den Schleimhäuten der oberen Atemwege zu finden ist. Unter bestimmten Umständen, die ein Eindringen ermöglichen oder fördern (beispielsweise beeinträchtigte epitheliale Barrieren oder ein geschwächtes Immunsystem), können entsprechende Infektionen - abgesehen von harmlosen Krankheitsverläufen wie Abszessbildung - in lebensbedrohlicher (Katheter-assoziierter) Bakteriämie mit begleitender Sepsis bis hin zu verschiedenen Toxin-verursachten Syndromen gipfeln. Auftreten und pandemische Ausbreitung von Isolaten, die resistent gegenüber Reserveantibiotika wie Penicillin, Vancomycin oder Methicillin sind, stellen in diesem Kontext eine massive Gefährdung der globalen Gesundheit dar. Dieser Sachverhalt erfordert neue Alternativen zum bislang recht limitierten Arsenal an Präventions- bzw. Behandlungsmöglichkeiten, und nur durch permanente Optimierung bzw. Verflechtung innovativer Technologien kann solch ein ambitioniertes Vorhaben auch tatsächlich realisiert werden. So könnten sogenannte Proteinchips aufgrund ihrer unbestrittenen Eignung zu Parallelisierung, Automatisierung, Miniaturisierung und Hochdurchsatz ein wertvolles Screening-Werkzeug im Bereich der Infektionsbiologie darstellen. Membranen oder anderweitige Oberflächen werden dazu mit hunderten Proteinen in vorab definierter, nachvollziehbarer Reihenfolge bedruckt und gegen biologisches Material von Interesse (Proteine, chemisch synthetisierte Verbindungen, Serum) getestet. Thema unseres bewilligten Hertha-Firnberg Projektes (T648-B22) war in diesem Zusammenhang die Assemblierung zweier verschiedener S. aureus Proteinchip-Prototypen, die sich hinsichtlich Produktionsweise, Zusammensetzung, Qualität und Umfang unterscheiden bzw. nach 3 Jahren erfolgreicher Arbeit nun für erste biologische Anwendungen bereitstehen. Ausgehend von unserer laborintern etablierten Genom-weiten Genkollektion (in rekombinierbarem Ausgangsformat) haben wir zuallererst ein systematisches S. aureus Expressions-ORFeome (bestehend aus 2562 Einzelkonstrukten) hergestellt. Unser daraus generierter Proteom-weiter Chip (Schnellverfahren) kombiniert das Bedrucken von transformierten E. coli Klonen, Induktion der Proteinexpression, Lyse, Screening und letztlich Detektion auf einer einzigen Nitrocellulosemembran. Parallel wurden in einem weiteren Ansatz 505 Genprodukte, die für bakterielles Wachstum bzw. Überleben essentiell sind, rekombinant exprimiert, einzeln via Metall-Affinitätschromatographie aufgereinigt und letztlich zur Herstellung eines fokussierten bona fide Proteinchips (90% fertig) verwendet. Nachdem in einem ersten Miniaturformat die spezifische Interaktion zwischen gespottetem rekombinantem pbp2-Protein und einer biotinylierten ?-Lactam-Verbindung erfolgreich nachgewiesen werden konnte, scheinen analoge Szenarien auch in größeren Dimensionen praktisch machbar. Darüber hinaus wurden diverse Ausweichstrategien ausgearbeitet (Vektorsystem zur Generierung sezernierter Proteinchips in Doppelmembrankonfiguration; S. aureus RN4220 Stammsammlung konstitutiver Überexpressionen) und Proteinfunktionalität / Aktivität in einer Reihe biologischer Assays detailliert validiert. Eine kontinuierliche Verbesserung unseres Produktes in Hinblick auf Qualität, Dimension und Sensitivität steht im Mittelpunkt nachfolgender Projektanträge, um selbiges zu einem noch robusteren, verlässlicheren Werkzeug auszubauen. Potentielle Anwendungsgebiete liegen im Bereich Protein-Protein Interaktionen, Charakterisierung diagnostischer Marker, Impfstoff-Kandidaten, bzw. Erforschung neuer Therapeutika (Identifizierung von Proteintargets für in Entwicklung befindliche Leitstrukturen; Testen von Substanzen nach verbesserter Selektivität gegenüber ihrem Zielmolekül).