Funktion von Spt5 und AID während der Antikörperreifung

Hintergrund: Antikörperreifung ist das Herzstück der humoralen Immunantwort, um das enorme Repertoire der Antikörper herzustellen, damit die tägliche Herausforderung gemeistert werden kann, unzählige mögliche Krankheitserreger zu bekämpfen. Dieser Prozess findet in den Immunglobulin (Ig)- Genen statt und beinhaltet DNA-Mutation, DNA-Reparatur und DNA-Rekombination. Das Enzym Activation Induced Deaminase (AID) initialisiert die Antikörperdiversifikation, indem es Mutationen in einzelsträngige DNA während der Transkription einführt. AID mutiert neben Ig-Genen auch andere Gene, wodurch es zur Instabilität des Genoms kommt. Folglich können Krebserkrankungen entstehen beispielsweise das Burkitt Lymphom oder das diffuse großzellige B-Zell Lymphom. Die Transkription von RNA ist essentiell für die Aktivität der AID. Unsere Forschungsgruppe konnte zeigen, dass das Protein Spt5, das für Transkriptionspausen mitverantwortlich ist, notwendig ist, um AID zu binden und Antikörperklassenwechsel, eine Form der Antikörperreifung, zu bewirken. Um die Rolle von Spt5 in diesen Prozessen noch detaillierter zu erforschen, etablierten wir ein konditionales Spt5 Knock-out Mausmodell. Erste Daten zeigten, dass der Verlust von Spt5 tatsächlich zu einem Verlust der AID-Bindung führt. Zusätzlich fanden wir auch, dass Spt5 Knock-out Mäuse eine fehlerhafte Interaktion zwischen Ig Enhancern und Promotoren, die wichtige Elemente der Transkriptionsregulation sind, aufweisen. Da diese Interaktion ebenfalls für die Antikörperreifung notwendig ist, weisen die Daten erstmals auf eine regulierende Funktion von Spt5 in der Enhancer- Promoter-Kommunikation hin. Besonders spannend sind unsere vorläufigen Daten im Bezug auf kürzlich veröffentlichte Studien, in denen gezeigt wurde, dass AID-Mutationen tatsächlich bevorzugt in Enhancer-Promoter-Clustern, die sogenannte topologisch assoziierte Domainen (TADs) bilden, zu finden sind. Dadurch rücken Enhancer und ihre Funktion in den Fokus der Erforschung, wie AID- Bindung und -Mutation auf spezielle Regionen der DNA gezielt stattfindet. Ziele des Forschungsprojekts: Basierend auf diesen Studien und unseren vorläufigen Daten, schlage ich die Hypothese vor, dass Spt5 durch seine regulierende Funktion der Enhancer-Promoter-Interaktion bewirkt, AID gezielt an DNA zu rekrutieren. In Spt5ko Zellen werde ich daher ein umfassendes Set an molekularbiologischen Techniken anwenden, mit dem Ziel zu untersuchen: (1) ob Spt5 diese Funktion spezifisch in Ig-Genen oder genom-weit ausübt und (2) welcher molekulare Mechanismus hinter der Funktion von Spt5 steckt. Hauptziel: Ich möchte die Funktion von Spt5 während der Antikörperreifung verstehen. Signifikanz des Projekts: Dieses Forschungsvorhaben zielt darauf ab, genauer zu verstehen, wie AID ihre Ziele in der DNA der B-Zellen während der Antikörperreifung findet. Weil die Funktion von AID wirklich ausschlaggebend ist für eine funktionierende humorale Immunantwort und die Entstehung vieler B-Zell Tumore, werden meine Forschungsergebnisse diese Fachgebiete stark bereichern und könnten zur verbesserten Bewertung der Entwicklungsstadien von B-Zell-Lymphomen führen.

Das Immunsystem besser verstehen! Um Krankheiten zu bekämpfen, müssen Antikörper Antigene auf Krankheitserregern mit der besten Passform binden. Dafür werden die Antikörpergene, wie Igh, mutiert. Zwei Prozesse tragen zur Antikörperreifung bei: Klassenwechsel-Rekombination und somatische Hypermutation. Beide hängen davon ab, dass Igh durch Transkription von DNA in RNA umgewandelt wird. Das Enzym RNA Polymerase II, kurz Pol II, und ein regulierendes Protein namens Spt5 sind dabei sehr wichtig. Als Ergebnis meines Forschungsprojekts konnten wir das bestehende Modell wie Antikörperklassenwechsel gelingt, anpassen, indem wir den Mechanismus entlarvten, durch den Transkription an mehreren Stellen im Igh-Gen die richtige Faltung des Gens bewirkt. Erstmalig zeigten wir außerdem, dass verschiedene Merkmale der aktiven Transkription und die Position der Mutationen während der somatischen Hypermutation nicht voneinander abhängen. Vielmehr schlagen wir vor, dass die umgebende DNA-Sequenz und die Beendigung der Transkription der Schlüssel zu den notwendigen Mutationen sind. Diese Erkenntnisse zeigen neue und unerwartete Mechanismen im Inneren der Zellen des Immunsystems auf, und helfen die Antikörperreifung immer genauer zu erklären. Nun zu den Details: Spt5 ist für die Transkription durch Pol II erforderlich, die an mehreren Stellen in Igh beginnt. Dabei handelt es sich um sogenannte regulatorische Sequenzen, Enhancer und Promoter, die sich durch Faltung der DNA in Schleifen nahekommen müssen. Fehlt Spt5, kommt es zu keiner Transkription und keiner Faltung. Spannenderweise haben wir zwei Mechanismen aufgedeckt, wie Spt5 die Schleifenbildung reguliert: Erstens aktiviert Spt5 die Transkription an Enhancern, was die Schleifenbildung zu Switch-Promotoren einleitet, zweitens schafft die Transkription von Switch-Promotoren eine lokale Barriere und sorgt dafür, dass eine DNA-Schleife dort endet. Infolgedessen bildet sich eine Doppelschleife, die drei DNA-Regionen des Antikörpergens nahebringt, darunter zwei Switch-Regionen. Diese unmittelbare Nähe ist wichtig, weil bei der Rekombination die DNA der beiden Switch-Regionen gebrochen wird und wieder korrekt verbunden werden muss, um schließlich nach dem Klassenwechsel erneut einen brauchbaren Antikörper zu erhalten. Im zweiten Teil konnten wir überraschenderweise zeigen, dass verschiedene Merkmale während der Transkription die exakten Positionen der Mutationen nicht bestimmen. Der Doppelstrang wird geöffnet, wenn sich Pol II entlang der DNA bewegt: sie startet, pausiert und bewegt sich in beide Richtungen auf dem Igh-Gen. Durch diese Merkmale der Transkription wird einzelsträngige DNA frei und es wurde bis jetzt angenommen, dass dadurch AID, das Enzym, das die Mutationen setzt, reguliert wird. Wir haben mehrere Sequenzen getestet, aber spezifische Starts oder Pausen von Pol II oder ein anderes Merkmal konnte die beobachteten Mutationsmuster nicht erklären. Als letzte Möglichkeit schlagen wir vor, dass die umgebende DNA die Muster beeinflusst. Dies und unsere neue Hypothese, wonach AID auf einzelsträngige DNA in dem kurzen Zeitfenster zugreifen kann, nachdem Pol II die Transkription beendet und abfällt und bevor sich die DNA wieder schließt, sind wichtige Fragen für die Zukunft. ursula.schoeberl@imp.ac.at