Trichosporon mycotoxinivorans Transformation

Das Mykotoxin Zearalenon (ZON) wird von verschiedenen Arten von pflanzenpathogenen Pilzen der Gattung Fusarium gebildet. Bei Fusarium-Befall von Nutzpflanzen (insbesonders Mais) kann es zu toxikologisch bedenklichen ZON-Gehalten von Nahrungsmitteln und Futtermitteln kommen. Von der EU-Kommission wurden strenge Maximalwerte für Nahrungsmittel erlassen, jedoch - um die Verwertung von kontaminiertem Erntegut weiterhin zu ermöglichen - vergleichsweise sehr hohe Richtwerte für Futtermittel. Auch bei Verwendung von Zearalenon-kontaminierten Getreide und Mais in der Bioethanol-Herstellung ergibt sich das Problem, dass Zearalenon in der als Eiweißfuttermittel verwendeten Trockenschlempe etwa dreifach angereichert wird. Lösungsmöglichkeiten wären die Entgiftung von ZON bereits im Feld durch entsprechende transgene Pflanzen, durch Herstellung von Mikroorganismen die entweder als Futtermittelzusatz oder bei der Bioethanol-Herstellung ZON detoxifizieren können, oder durch Entwicklung von Enzympräparationen, die ZON inaktivieren. Die Hefe Trichosporon mycotoxinivorans kann ZON in einen nicht mehr östrogen Metaboliten (ZOM-1) umzuwandeln. Ziel des vorliegenden Projektes ist es, für diese Basidiomyceten-Hefe ein Transformationssystem zu entwickeln, um die relevanten ZON-Detoxifikationsgene zu klonieren. In Vorarbeiten wurde eine auxotrohphe Mutante (Arg - ) isoliert, die ZON nicht mehr detoxifizieren kann. Im Projekt soll nun entweder auf Basis von dominanten Drogenresistenzmarkern oder durch Komplementation des Defektes in der Arginin-Biosynthese ein Transformationssystem entwickelt werden. Dieses soll dazu verwendet werden, genomische Klone zu identifizieren, die den Defekt der Mutante bezüglich der Fähigkeit ZON abzubauen, komplementieren. Der postulierte Abbauweg in T. mycotoxinivorans verläuft in zwei enzymatischen Schritten. Das hypothetische Intermediat ist jedoch derzeit nicht verfügbar. Ein weiteres Ziel des Projektes ist daher, dieses Intermediat durch de novo Synthese chemisch herzustellen und seine toxikologischen Eigenschaften, insbesonder die östrogene Wirkung, zu testen. Die Verfügbarkeit dieser Substanz sollte es auch ermöglichen, Strategien zur Klonierung des für den zweiten Reaktionsschritt verantwortlichen Gens zu entwickeln. Die Verfügbarkeit der ZON-Detoxifikationsgene aus Trichosporon ist eine Voraussetzung für die Übertragung dieser Fähigkeit auf andere Organismen, und weitere mögliche Anwendungen und Produktentwicklungen.

Die Basidomyceten-Hefe Trichosporon mycotoxinivorans ist imstande das stark östrogen wirksame Fusarium-Mykotoxin Zearalenone zu detoxifizieren. In einer früheren Arbeit wurde ein zweistufiger Abbauweg zum inaktiven Metabolit ZOM-1 postuliert, das Intermediat konnte jedoch mit den damals zur Verfügung stehenden Methoden nicht detektiert werden. Vermutlich verläuft der erste Reaktionsschritt, die Einführung eines Sauerstoffatoms in den Makrozyklus neben einer Keto-Gruppe (sogenannte Baeyer Villiger Reaktion) sehr langsam, während die Hydrolyse des dabei gebildeten Lactons rasch erfolgt. Ziel des Projektes war die Klonierung relevanter Gene dieses Abbauweges. Zu Projektbeginn stand einen Mutante zur Verfügung, die nicht mehr zur Zearalenon-Detoxifikation befähigt ist. Die Entwicklung eines Transformationssystems sollte daher die Isolierung des Gens durch Komplementation des Defektes erlauben. Es wurde eine Strategie entwickelt, die es ermöglicht mittels des Cre-lox Systems in excisierte Klone einer Phage Lambda Genbank dominante Selektionsmarker nachträglich einzufügen. Da die Effizienz dieses Retrofittings und vor allem die Transformationseffizienz von Trichosporon zu gering war, um die ursprünglich vorgeschlagene Strategie aussichtsreich erscheinen zu lassen, wurde ein neuer Ansatz gewählt. Die vollständigen Genomsequenzen des Wildtyps und der Mutante wurden ermittelt und verglichen. Die durch Neutronen- und Gamma-Bestrahlung hergestellte Mutante wies eine große Deletion auf, in der ein Kandidatengen mit Sequenzähnlichkeit zu Baeyer-Villiger Monooxygenasen identifiziert wurde. Dieses Gen konnte in Bäckerhefe exprimiert werden, und Transformanten waren im Gegensatz zur Kontrolle imstande Zearalenon zu metabolisieren. Die gebildete Substanz wurde aufgereinigt und mittels NMR konnte bestätigt werden, dass diese Hefen das postulierte Intermediat bilden. Mit der gereinigten Substanz konnten Tests auf östrogene Wirkung durchgeführt werden, die ergaben, dass schon der erste Schritt zu einer mehr als 100-fachen Reduktion der östrogenen Aktivität führt.Für das klonierte Gen gibt es mehrere Anwendungsmöglichkeiten. Es könnte einerseits in Pflanzen eingebracht werden, sodass z.B. transgener Mais Zearalenon im Idealfall schon am Entstehungsort inaktivieren kann. Hochkontaminiertes Getreide und Mais werden oft der Bioethanolproduktion zugeführt, wobei das stabile Toxin jedoch aufkonzentriert wird. Hefen mit der Fähigkeit zur Detoxifikation während der Fermentation wären eine mögliche Lösung um Zearalenone im als Nebenprodukt entstehenden wertvollen Eiweißfuttermittel zu reduzieren. Möglicherweise könnte auch das gereinigte Genprodukt als Enzym zur Entgiftung, z.B. als Futtermittelzusatz, verwendet werden. Der Prozess zum Schutz dieser Erfindung wurde daher eingeleitet.