Rekombinante Glykosidasen als Tools in der Forschung

Die Bedeutung der Glykosylierungsabläufe und die daraus resultierenden Glykokonjugate sind im Gesundheits und Krankheitswesen weitgehend bekannt. Die Diversität der Glykokonjugate in der Natur, einschließlich des Glykom der Invertebraten, durchaus komplexer als bisher gedacht, stellen eine Herausforderung bezüglich ihrer Strukturaufklärung dar. Daher fordert die Freisetzung der Glykane von den Proteinen/Peptiden eine genauere Abwägung. Unterschiedliche Versuche, enzymatisch oder chemisch, können zu verschieden isolierten Glykangruppen führen. Meist wird die N-Glykosidase aus Mandeln zur Freisetzung der Glykane aus Glykopetiden verwendet. Eine weitere Glykosidase ist die Drosophila Fdl; sie kann das am alpha 1,3 Arm gebundene N- Acetylglucosamin am N-Glykan spezifisch freisetzen. Um die Anwendung dieser Enzyme zu optimieren, beabsichtige ich rekombinante Formen derselben herzustellen und diese auf ihre Substratanforderungen und optimalen Arbeitsbedingungen zu untersuchen. Das Endergebnis sollten reine, gut charakterisierte, und wenn möglich, immobilisierte Formen dieser Enzyme sein, die die Entwicklung von neuen, schnelleren, und robusten Methoden der N-Glykan-Analyse ermöglichen sollten.

Die Erforschung von komplexen Molekülen, die in lebenden Organismen gefunden wurden, benötigt unterschiedliche analytische Hilfsmittel. Auch wenn die modernen analytischen Instrumente eine detaillierte Untersuchung von verschiedenen Proben ermöglichen, wird es oft ein zusätzlicher Nachweis erwünscht oder ist aber auch erforderlich. Zu diesem Zweck verwenden Forscher gut charakterisierte Enzyme, die spezifisch einzelne Bausteine dieser Makromoleküle abbauen können. In diesem Projekt wurde ein kosten-effektives Herstellungsverfahren für Enzyme, die einzelne Monosaccharide oder auch lange Saccharidketten aus bestimmten Proteinen (z.B. Antikörper IgG) erfolgreich abbauen können, in Hefen- und Insektenzellen etabliert. Die Eigenschaften dieser Enzyme wurden ausführlich untersucht, indem eine breite Auswahl an eigens für die Enzyme hergestellten natürlichen und künstlichen Substraten getestet wurde. Darüber hinaus wurde auch die Beschaffenheit dieser Enzyme mit bereits bekannten, verwandten Enzymen, und auch mit welchen, die direkt aus Organismen aufgereinigt wurden, verglichen. Somit konnten nicht nur neue Erkenntnisse über die Aktivität und Sensitivität der Enzyme gegenüber unterschiedlichen Molekülbausteinen unter verschiedenen Bedingungen, sondern auch über die Limitierungen ihrer Anwendung, gewonnen werden. Aus diesem Projekt resultiert also eine Reihe an gut charakterisierten Enzymen, die als solche den Forschern verfügbare analytische Hilfsmittel erweitern. Zudem, die Projektergebnisse über eine weitere Enzymgruppe unterstützen die Bemühungen in der Lebensmitteltechnologie und Medizin in Hinsicht auf Laktoseintoleranz.