Fett für Biodiesel: Optimierung der Lipidproduktion in Hefe

Biodiesel stellt eine wertvolle Alternative zu aus Erdöl gewonnenem Diesel dar. In seinem Verhalten bei der Verbrennung ist er dem herkömmlichen Diesel sehr ähnlich. Da er aber aus erneuerbaren Rohstoffen produziert wird, ist sein Preis und seine Verfügbarkeit nicht so stark von welt- und wirtschaftspolitischen Einflüssen abhängig. Als Ausgangsmaterial für Biodiesel dienen derzeit hauptsächlich Fette und Öle (Triglyzeride, TG) pflanzlicher oder tierischer Herkunft. Da der großflächige Anbau von ölreichen Pflanzen für die Biodieselproduktion aber zu einer Konkurrenzsituation mit dem Anbau von Nahrungsmitteln geführt hat, wird nach alternativen Quellen für die Öl- Gewinnung gesucht.. Eine Möglichkeit stellt die Öl-Produktion mit Mikroorganismen dar. Einige Hefen und einzellige Algen produzieren unter bestimmten Bedingungen große Mengen von Öl. Im Rahmen diese Projektes werden wir versuchen, die Fettproduktion in Hefezellen hinsichtlich Ausbeute und Wachstumsbedingungn zu optimieren. Die Maximierung des Fettgehaltes ist eine wichtige Voraussetzung, um einen Prozess zur Ölproduktion mit MO im großen Maßstab wirtschaftlich führen zu können. Yarrowia lipolytica (Y.l.) ist eine der Hefen, die sehr viel TG produzieren und speichern können, während die bekannte Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae, S.c.) dazu nicht in der Lage ist. In diesem Projekt suchen wir nach den Ursachen für dieses unterschiedliche Verhalten. Durch die Identifizierung der Faktoren, die für diese Unterschiede verantwortlich sind, erwarten wir uns ein besseres Verständnis der Mechanismen, die die Fettspeicherung beeinflussen. Um die gesuchten Faktoren zu identifizieren, werden wir das metabolische Netzwerk von Y.l. rekonstruieren und für Fließgleichgewichts-Analysen (flux balance analysis, FBA) verwenden. FBA ist eine Methode, die es erlaubt, metabolische Flüsse auf Basis einer stöchiometrischen Matrix zu analysieren. Wir werden die Resultate dieser Simulation mit den entsprechenden Resultaten eines bereits existierenden Bäckerhefe-Modelles vergleichen. Diese vergleichende Analyse ermöglicht die Identifizierung von Flüssen, die sich in den beiden Modellen stark unterscheiden. Von der Annahme ausgehend, dass die betroffenen Reaktionen einen Einfluss auf den Fettstoffwechsel haben, werden wir Resultate der Computer-gestützten Analysen mit experimentellen Methoden überprüfen. Darüberhinaus werden wir 13C-Flussanalysen und Metabolom-Analysen durchführen, um ein möglichst umfassendes Bild von den Veränderungen zu erhalten, zu denen es bei einer Erhöhung des Flusses in die Lipidsynthese kommt. Wir werden die Erkenntnisse aus dieser analytischen Arbeit dafür verwenden, Bäckerhefe und Y.l. genetisch zu modifizieren, sodass sie in der Lage ist, größere Mengen an Neutrallipid zu produzieren als die entsprechenden Wildtyp-Hefen. Das Ziel dieser Arbeit ist es, möglichst alle Faktoren zu identifizieren, die den Stoffwechsel einer Zelle in Richtung Fettsynthese optimieren. Durch eine Kombination dieser Faktoren in einer Zelle soll eine Maximierung der Fettspeicherung erzielt werden.

Biodiesel ist biologisch abbaubar und ist ein Beitrag zur Entwicklung in Richtung einer bioökonomischen Gesellschaft. Derzeit wird der Großteil des Biodiesels aus Pflanzenölen (Triacylglycerin, TAG) hergestellt. Bedenken, dass es durch diese Vorgehensweise zu einer Konkurrenz zwischen dem Anbau von Ölpflanzen für die Biodieselproduktion und dem Anbau von Lebensmitteln kommen wird ('Tank oder Teller'), führten zu Bemühungen, diese Pflanzenöle durch Öle von gleichwertiger Qualität zu ersetzen, die biotechnologisch mithilfe von Mikroorganismen, z.B. Mikroalgen oder Hefen, hergestellt werden.In diesem Projekt optimierten wir die Biosynthese und Speicherung von TAG in Hefe. Hefen sind einzellige eukaryotische Mikroorganismen. Alle Eukaryonten produzieren TAG zur Speicherung von Energie und Kohlenstoff, sie unterscheiden sich jedoch beträchtlich hinsichtlich des Ausmaßes, in dem dieser Prozess aktiv ist. Manche sogenannte 'Fetthefen' speichern sehr große Mengen an Fett unter geeigneten Bedingungen und sind dadurch die vielversprechendsten Kandidaten für die biotechnologische Produktion von Ölen. Eine dieser Fetthefen ist Yarrowia lipolytica, eine nicht-pathogene Hefeart, deren Genom bereits sequenziert ist und für die auch einige Methoden zur genetischen Manipulation verfügbar sind. Wir haben das zelluläre metabolische Netzwerk von Y. lipolytica rekonstruiert, um einen besseres Verständnis über die Biosynthese von TAG in dieser Hefe zu erhalten. Dabei werden alle in einer Zelle bekannten chemischen Reaktionen in einem Computermodell zusmmengefasst. Durch die Verwendung von Fließgleichgewichts-Analysen (Flux balance analysis, FBA) kann so der zelluläre Stoffwechsel simuliert und Vorhersagen über die Auswirkungen von Veränderungen in der Umwelt oder von Mutationen getroffen werden. Dadurch liefert FBA eine wertvolle Unterstützung in der Generierung von Hypothesen und im experimentellen Design. Durch Kombination von Computer-Simulationen und experimenteller Überprüfung haben wir so Prozessbedingungen entwickelt, die zu einer deutlichen Verbesserung der Speicherung von TAG und zu einer Steigerung der Ausbeute führten. Weiters haben wir mithilfe dieses Modells diejenigen Faktoren identifiziert, die möglicherweise die Effizienz bzw. Produktivität des TAG-Stoffwechselweges limitieren. Darauf aufbauend wurden mehrere genetische Modifikationen durchgeführt, die die Synthese und Speicherung von TAG verbessern. Beispielsweise wurde die Synthese von Glykogen unterbunden, nachdem wir gefunden hatten, das Y. lipolytica große Mengen davon speichert. Durch die Deletion dieses Weges kommt es zu einer verstärkten Speicherung von TAG. Weiters haben wir ein Protein charakterisiert, das andere Enzyme daran hindert, TAG abzubauen. Durch dessen Überexpression wurde die TAG-Speicherung ebenfalls verbessert.Zusammenfassend haben wir die TAG-Speicherung in Y. lipolytica durch eine Optimierung der Prozessführung und durch genetische Modifikationen entscheidend verbessert