Regulation und Funktion von neuen Gehirn-spezifischen PGC-1alpha isoformen

Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Störungen in der Expression und Funktion von PGC-1alpha für die Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen von Bedeutung sind. Studien über einen Sequenz-Polymorhpismus (rs7665116), der mit dem Erkrankungsalter der Huntington`schen Krankheit (HK) assoziiert war, führten zur Beschreibung multipler PPARGC1A Transkripte, die von einem bisher nicht bekannten Promoter, der 587 kb stromaufwärts von Exon 2 liegt, initiiert werden. Unter Verwendung von "real-time" PCR, RNase Protection Assays und Northern Analyse konnten wir zeigen, dass diese Transkripte vorwiegend im Gehirn exprimiert werden, daher gehirn-spezifisch sind und einen höheren Gewebsspiegel aufwiesen als Transkripte, die vom Referenzgen initiiert werden. Die beiden gehirn-spezifischen Haupttranskripte haben unabhängige Methionin-Startkodone und kodieren für Proteine, die sich vom bisher bekannten PGC-1alpha nur am N-terminus unterscheiden. Verkürzte Isoformen, die ebenfalls die neuen N-Termini aufweisen, sind dem N-terminalen (NT)-PGC-1alpha ähnlich. Andere, ebenfalls verkürzte gehirn-spezifische PGC-1alpha Proteine dürften einen dominant negativen Effekt haben, da das zweite LXXLL Motiv, das mit diversen Transkritpionsfaktoren interagiert, durch eine andere Aminosäuresequenz ersetzt ist. Der neue gehirn-spezifische Promoter ist in neuronalen Zelllinien aktiv. Wir konnten zeigen, dass spezifische Haplotypen innerhalb des gehirn-spezifischen Promoters mit dem HK Erkrankungsalter assoziiert sind. Diese neuen Erkenntnisse über die unerwartete Größe des PPARGC1A Lokus und die Identifizierung von gehirn-spezifischen PGC-1alpha Isoformen rechtfertigen weitere Studien, die die Steuerung und Funktion dieser Isoformen aufklären. Der Hauptzweck dieses Antrages ist es, die Funktion und Regulation der gehirn-spezifischen Isoformen mit PGC- 1alpha, das vom Referenzgen kodiert wird, im menschlichen Gehirn und neuronalen Zellmodellen zu vergleichen. Ein sekundärer Zweck ist es, dahingehend Einblick zu bekommen, ob potentielle Unterschiede in Funktion und Regulation dieser Proteine die Pathogenese von HD und der Parkinson`schen Krankheit (PD) beeinflussen. Zur Beantwortung dieser Fragen sollen folgende Experimente durchgeführt werden: i) Quantifizierung der gehirn- spezifischen und Referenz-Transkripten and Proteinen in HD transgenen Mausmodellen, die neuroprotektive Substanzen erhielten und in Konrollen, in humanen post-mortem Gehirnproben und in zellulären Modell für HD und PD; ii) funktionelle Charakterisierung der gehirn-spezifischen Isoformen im Vergleich zu Referenz-PGC- 1alpha in Kontroll- sowie HD und PD Zellkulturmodellen hinsichtlich deren Koaktivierungseigenschaften, Bioenergetischer Funktion und Protektion von Sauerstoffradikalen (ROS); iii) Charakterisierung des gehirn- spezifischen PPARGC1A Promoters in Vergleich zum Referenzgen-Promoter und Aufklärung der Signaltransduktionswege, die diese beiden Promoterregion kontrollieren. Durch diese Studien sollten essentielle Daten über die gehirnspezifischen Isoformen und deren potentielle Bedeutung bei neurodegenerativen Erkrankung erworben werden, sodass neue gewebs-spezifische Angriffspunkte zur Behandlung dieser Erkrankungen aufgezeigt werden sollten.

Die Parkinsonsche (PK) und Alzheimersche (AK) Krankheit sind weltweit die häufigsten neurodegenerativen Krankheiten (NK). Obwohl klinische Symptomatik und neuropathologische Befunde bei PK und AK unterschiedlich sind, zeigten experimentelle und genetische Studien, dass ein verminderter Abbau spezifischer Proteine durch Proteasom und/oder Lysosom-Autophagy, fehlerhafte Funktion der Mitochondrien und zelluläre Schädigung durch Sauerstoffradikale bei beiden Krankheiten von Bedeutung sind. PGC-1? ist ein Ko-Aktivator der Transkription und wird von PPARGC1A kodiert. PGC-1? ist essentiell für die Integration biologischer Programme, die in der Pathogenese der NK eine Rolle spielen und die mitochondriale Biogenese und Funktion, die Entgiftung von Sauerstoffradikalen sowie den Abbau von Proteinen steuern. Wir haben kürzlich zahlreiche PPARGC1A Transkripte entdeckt, die ca. 550 kb stromaufwärts vom bisher bekannten Startpunkt initiiert werden und im zentralen Nervensystem (ZNS), nicht jedoch in anderen Geweben nachgewiesen werden konnten. Der Spiegel dieser Transkripte ist im ZNS deutlich höher als der vom Referenzgen (RG) gebildeten Transkripte. Zwei ZNS-spezifische Transkripte mit unterschiedlichen Startkodons für Methionin kodieren für zwei ZNS-spezifische Proteine, die sich vom Referenzprotein lediglich am Amino-Terminus unterscheiden. Zusätzlich gibt es eine Reihe von verkürzten ZNS-spezifischen Isoformen, die durch unterschiedliches Spleißen von Transkripten entstehen. Die Zielsetzung des Projektes war, basale Information über die Expression und Funktion der ZNS-spezifischen PGC-1? Isoformen zu gewinnen. Wir bestimmten die Spiegel von ZNS- und RG Transkripten in post-mortem Hirngeweben von PK Fällen und Kontrollen und beobachteten bei PD ein Reduktion der ZNS-Transkripte in der Substantia nigra, die auf eine Verminderung von dopaminergen Neuronen zurückgeführt wurde. Zusätzlich wurde in der Substantia nigra von PD eine Vermehrung von Transkripten beobachtet, die für ein ZNS-spezifisches verkürztes 17 kDa Protein kodieren. Dieses Protein hemmte die Funktion der regelrechten, unverkürzten PGC-1? Isoformen. Zusätzlich haben wir in genetischen Studien von klinischen und post-mortem Stichproben Haplotypen (Kombinationen von Sequenz-Varianten) identifiziert, die das Risiko für PD deutlich verringerten. ZNS-spezifische PPARGC1A Transkripte waren auch in post-mortem Gehirngeweben von AK Fällen verringert. Weitere Studien zeigten, dass PGC-1? ein mitochondriales Protein namens TOMM40 induziert, das aufgrund von Assoziations-Studien bei AD eine Rolle spielen dürfte. Schließlich identifizierten wir mehrere Signalwege, die die Bildung der ZNS-spezifischen Isoformen steuern. Bemerkenswert ist vor allem die Hypoxie, die via HIF1A und HIF2 zu einer vermehrten Expression der ZNS-Isoformen führt, was sowohl in Zellkulturen als auch in einem Tiermodell gezeigt wurde. Zusammenfassend haben unsere Studien neue Einsicht in die Pathogenese von häufigen NK gebracht und Hypothesen generiert, die in zukünftigen Studien getestet werden können