DeCOP -Koordination genetischer Rekombination in Pflanzen

Sexuelle Reproduktion beginnt mit einer spezialisierten Zellteilung, der Meiose, bei der das Genom eines Organismus in generativen Zellen auf die Hälfte reduziert wird und chimäre Chromosomen, zusammengesetzt aus vormals mütterlichen und väterlichen Erbgutanteilen, entstehen. Bei der meiotischen homologen Rekombination (HR) werden die elterlichen Chromosomen kontrolliert geschnitten und neu zusammengefügt. Das Schneiden wird von einem Proteinkomplex mit dem SPO11 Protein als zentralen Mediator durchgeführt. Die Schnittstellen stellen auch potentielle Regionen zukünftigen genetischen Austausches dar ("crossover" CO). Allerdings wird in einer individuellen meiotischen Zelle nur ein kleiner Teil der eingeführten Doppelstrangbrüche (DSBs) so repariert, dass chimäre Chromosomen entstehen. Die meisten DSBs werden auf anderem Wege, wie z.B. über Schwesterchromatiden, repariert. Die Zahl und die Position von genetischen Austäuschen in einer Zelle (COs) unterliegen strikter Kontrolle: jedes homologe Chromosomenpaar bekommt zumindest ein CO pro Meiose und andere Mechanismen (CO Interferenz) sorgen dafür, dass weitere COs nicht in der Nähe gebildet werden. Darum sind COs entlang von Chromsomen relativ gleichmäßig weit voneinander entfernt. Ein tiefergehendes Verständnis dieser Vorgänge ist nicht nur von grundlegendem, wissenschaftlichem Interesse, sondern könnte auch dazu dienen, Züchtungsprogramme von Nutzpflanzen zielgerichteter und schneller durchzuführen. In den letzten Jahren hat sich die Meioseforschung in Pflanzen eher auf das Auffinden und Charakterisieren von einzelnen Faktoren konzentriert, die in separaten Prozessen in der Meiose, wie zum Beispiel der HR oder der Organisation des meiotischen Chromatins (Achsen und Synaptonemaler Komplex) eine Rolle spielen. Wenngleich diese Studien wichtige Erkenntnisse geschaffen haben, so ist weiterhin unklar wie die einzelnen Prozesse in der Meiose koordiniert werden um genetische Rekombination zu ermöglichen. Das vorliegende kollaborative Projekt (DeCOP) konzentriert sich auf genetische Rekombination (DSB und CO Ausbildung) im Kontext der Chromatinstruktur und möchte dynamische Prozesse der Chromatinreorganisation nach dem DNS-Bruch und die Konsequenzen auf den Austausch genetischer Information studieren. Im speziellen wird 1) ein innovativer, genetischer Screen zur Identifikation neuer CO Faktoren durchgeführt, 2) die Rolle von "Achsen" Proteinen im Bezug auf CO Ausbildung und Interferenz untersucht, 3) die Rolle von (ATM/ATR vermittelter) Phosphorylierung in der Koordination meiotischer DNA Reparatur und CO Ausbildung untersucht, und es werden 4) neue Faktoren im finalen Schritt der CO Ausbildung identifiziert. Die im DeCOP Projekt studierten Mechanismen werde signifikant zu einem tieferen Verständnis jener Netzwerke in Pflanzen führen die DSB und CO Ausbildung kontrollieren. Weiters werden die hier beschriebenen Ansätze moderne Strategien in Pflanzenzüchtungsprogrammen zugute- kommen. Die Arbeitsgruppe Mechtler wird diverse, auf Massenspektrometrie basierende, bioanalytische Methoden im Kontext der biologischen Fragestellungen des Antrags anwenden, entwickeln und optimieren. Die zwei Hauptgebiete sind einerseits die Aufklärung der Komposition von prozeßrelevanten Proteinkomplexen und zweitens die Entschlüsselung der Aktivität von Kinasen innerhalb der meitotischen Zellteilung. In der zunächst genannten Fragestellung werden spezielle, isotopenmarkierungsfreie Methoden zur Anwendung kommen. Um falsch positive Resultate auszuschließen werden wir auch Methoden einsetzten die zu der kovalenten Vernetzung von Proteinkomplexen führen. In dem anderen Hauptgebiet werden wir eine analytische Strategie bestehend aus Istopenmarkierung und diversen spezifischen chromatographischen Methoden einsetzen um die Konsequenzen von Mutationen in relevanten Kinasen aufzuklären. Die Strategie erlaubt uns Proteine zu identifizieren die durch diese Kinasen reguliert werden.

Sexuelle Reproduktion beginnt mit einer spezialisierten Zellteilung, der Meiose, bei der das Genom eines Organismus in generativen Zellen auf die Hälfte reduziert wird und chimäre Chromosomen, zusammengesetzt aus vormals mütterlichen und väterlichen Erbgutanteilen, entstehen. Bei der meiotischen homologen Rekombination (HR) werden die elterlichen Chromosomen kontrolliert geschnitten und neu zusammengefügt. Das Schneiden wird von einem Proteinkomplex mit dem SPO11 Protein als zentralen Mediator durchgeführt. Die Schnittstellen stellen auch potentielle Regionen zukünftigen genetischen Austausches dar (crossover CO). Allerdings wird in einer individuellen meiotischen Zelle nur ein kleiner Teil der eingeführten Doppelstrangbrüche (DSBs) so repariert, dass chimäre Chromosomen entstehen. Die meisten DSBs werden auf anderem Wege, wie z.B. über Schwesterchromatiden, repariert. Die Zahl und die Position von genetischen Austäuschen in einer Zelle (COs) unterliegen strikter Kontrolle: jedes homologe Chromosomenpaar bekommt zumindest ein CO pro Meiose und andere Mechanismen (CO Interferenz) sorgen dafür, dass weitere COs nicht in der Nähe gebildet werden. Darum sind COs entlang von Chromsomen relativ gleichmäßig weit voneinander entfernt. Ein tiefergehendes Verständnis dieser Vorgänge ist nicht nur von grundlegendem, wissenschaftlichem Interesse, sondern könnte auch dazu dienen, Züchtungsprogramme von Nutzpflanzen zielgerichteter und schneller durchzuführen. Das vorliegende kollaborative Projekt (DeCOP) konzentrierte sich auf genetische Rekombination (DSB und CO Ausbildung) im Kontext der Chromatinstruktur und studierte dynamische Prozesse der Chromatinreorganisation nach dem DNS-Bruch und die Konsequenzen auf den Austausch genetischer Information. Im speziellen wurde 1) ein innovativer, genetischer Screen zur Identifikation neuer CO Faktoren durchgeführt, 2) die Rolle von Achsen Proteinen im Bezug auf CO Ausbildung und Interferenz untersucht, 3) die Rolle von (ATM/ATR/CK2 vermittelter) Phosphorylierung in der Koordination meiotischer DNA Reparatur und CO Ausbildung untersucht, und es wurden 4) neue Faktoren im finalen Schritt der CO Ausbildung identifiziert. Die Arbeitsgruppe von Karl Mechtler am Forschungsinstitut für Molekulare Pathologie identifizierte mit Hilfe von Massenspektrometrie (MS) die Bindungspartner und Modifikationsmuster verschiedener meiotischer Proteinkomplexe. Weiters wurde ein proteomweiter MS-screen durchgeführt, um Substrate der Kinasen ATM, ATR und CK2 im DNA Reparatur Signalweg zu untersuchen. Schließlich wurden neue, auf chemischem cross- linking basierende MS-Methoden etabliert, um dynamische Strukturänderungen in Proteinkomplexen detektieren zu können.