Akt Aktivierung durch den Salmonella Effektor SopB

Salmonella Typhimurium ist ein Erreger, der durch Lebensmittel übertragen wird und bei Kindern oder immunsupprimierten Menschen zum Tode führen kann. Die Bakterien haben die Fähigkeit sich intrazellulär in speziellen Vakuolen (Salmonella containing vacuoles: SCVs) zu vermehren. Dafür verwenden sie einen Typ III Sekretionsapparat, mit dem sie ihre Effektorproteine direkt ins Zytoplasma der Zielzelle injizieren. Das Effektorprotein SopB, welches Signaltransduktionswege in der Zelle beeinflusst, spielt eine wichtige Rolle bei S. Typhimurium Infektionen. SopB aktiviert unter anderem die Kinase Akt und verhindert dadurch Apoptose in infizierten Zellen. Der Mechanismus der SopB-abhängigen Akt Aktivierung unterscheidet sich von der Aktivierung durch Wachstumsfaktoren oder Insulin und ist noch nicht beschrieben worden. Um diese genauer zu untersuchen, sind die spezifischen Ziele dieses Antrages: 1. Einfluß der Phosphatidylinositol (PI)-Kinasen auf die PI(3,4)P2 /PI(3,4,5)P 3 Produktion durch SopB: SopB ist verantwortlich für die Bildung von PI(3,4)P2 /PI(3,4,5)P 3 an Membranstrukturen während der Aufnahme von Salmonellen. Vorangegangene Experimente zeigten, daß diese verantwortlich sind für die Aktivierung von Akt und daß keine bekannte PI3-Kinase dafür verantwortlich ist. Außerdem konnte ich in Hefen, ein Organismus mit einem vereinfachten PI-Metabolismus der normalweise kein PI(3,4,5)P3 besitzt, PI(3,4)P2 /PI(3,4,5)P 3 durch Transformation von SopB generieren. Ich werde den Einfluß von PI-Kinasen auf die PI(3,4)P2 /PI(3,4,5)P 3 Bildung durch SopB in mutierten Hefe Stämmen testen. Des Weiteren werde ich in HeLa Zellen mitttels siRNA den Einfluß von PI4- bzw PIP-Kinasen auf SopB-induzierte Bildung von PI(3,4)P2 /PI(3,4,5)P 3 testen. 2. Testen der Möglichkeit eines Phosphotransfer Mechanismus durch SopB: Ich werde in-vitro testen ob SopB eine bis jetzt nicht beschriebene enzymatische Aktivität besitzt und alleine verantwortlich ist für PI(3,4)P2 /PI(3,4,5)P 3 Produktion durch Dephosphorylierung von PI(4,5)P2 . Mit Hilfe der geplanten Untersuchungen werde ich einen neuen Mechanismus der Akt Aktivierung charakterisieren und dazu beitragen, die Mechanismen, die den Bakterien ein intrazelluläres Überleben ermöglichen, wie die Manipulation der PI Signalwege, aufzuklären.