Deoxynivalenol-Detoxifizierung durch Glutathiontransferasen

Pilze der Gattung Fusarium stellen ein erhebliches Problem in der weltweiten Getreideproduktion dar, da sie Ernteverluste und Belastung mit Mykotoxinen verursachen. In Europa wird vorwiegend Deoxynivalenol (DON) von der weit verbreiteten Art Fusarium graminearum gebildet. Dieses Toxin dient der Ausbreitung des Pilzes auf der Wirtspflanze, ist aber nach Aufnahme von Getreideprodukten auch für Menschen und Tiere toxikologisch höchst problematisch. Da DON chemisch sehr stabil ist und auch durch Erhitzen nicht zerstört wird, sind Strategien zu dessen Entgiftung von hohem Interesse. Im bereits abgeschlossenen FWF Projekt SFB Fusarium lag ein wesentlicher Fokus unserer Arbeitsgruppe auf der Isolierung vorwiegend pflanzlicher Enzyme mit der Fähigkeit zur DON-Entgiftung. Während die meisten der bisher charakterisierten Enzyme umkehrbare Reaktionen katalysieren, konnten wir Glutathiontransferasen identifizieren, die DON irreversibel entgiften. Dabei wird dessen Epoxidgruppe, die auch hauptverantwortlich für die Toxizität ist, durch Bindung an Glutathion permanent eliminiert. Während die bisher untersuchten pflanzlichen Glutathiontransferasen diese Epoxid-Öffnung relativ langsam katalysieren, konnten wir vor kurzem auch einige hocheffiziente Pilz-Glutathiontransferasen identifizieren. Das Ziel dieses Projekts ist, die Reaktionsmechanismen solcher Glutathiontransferasen aufzuklären. Dafür wird die Röntgenstrukturanalyse eingesetzt. Die betreffenden Enzyme werden rekombinant im Wirtsorganismus Escherichia coli produziert, mittels Affinitätschromatographie gereinigt und anschließend gemeinsam mit DON oder dem entgifteten Reaktionsprodukt (DON-Glutathion) kristallisiert. Die Struktur dieser Komplexe wird durch Röntgenbeugung ermittelt. Dies soll darüber Ausschluss geben, wie DON während der Katalyse im aktiven Zentrum positioniert ist und welche Aminosäuren an der Reaktion beteiligt sind. Die katalytische Funktion spezifischer Aminosäuren wird überprüft, indem diese durch gezielte Mutagenese ausgetauscht werden und die Funktionalität der modifizierten Enzyme erneut getestet wird. Die vom FWF durch das Schrödinger Programm finanzierten Arbeiten werden in einem Zeitraum von zwei Jahren an der Universität Turku, Finnland durchgeführt. In der einjährigen Rückkehrphase an der BOKU werden die Enzyme bzw. Mutanten dann enzymkinetisch genauer charakterisiert. Die geplanten Arbeiten sollen die Grundlage für das Verständnis der biokatalytischen Entgiftung von DON und chemisch eng verwandter Toxine (Trichothecene) wesentlich erweitern. Die biochemische Charakterisierung der involvierten Glutathiontransferasen sollte auch zu neuen Einsichten bezüglich deren Rollen in Pflanzen und Pilzen führen und könnte Hinweise zur Verbesserung der Fusarium Resistenz von Nutzpflanzen durch gezielte Züchtung bzw. Genom Editierung liefern.

Getreidearten wie Weizen, Gerste und Mais sind häufig von Fusarium-Pilzen befallen, was zu drastischen Ertragsverlusten und der Kontamination mit schädlichen Mykotoxinen führt. Insbesondere Deoxynivalenol (DON), das von der weit verbreiteten Art Fusarium graminearum produziert wird, ist ein in Europa häufig vorkommendes Mykotoxin. DON dient als Virulenzfaktor, der die Ausbreitung des Pilzes auf der Wirtspflanze fördert, und ist bei der Aufnahme kontaminierter Getreideprodukte sowohl für Menschen als auch für Tiere hochgiftig. Die Erforschung der enzymatischen DON-Entgiftung ist von Bedeutung, um die molekularen Mechanismen der Fusarium-Resistenz in Pflanzen besser zu verstehen und neue Strategien zur Reduktion der DON-Belastung und des damit verbundenen Risikos für Mensch und Tier zu entwickeln. Ein wichtiger Abwehrmechanismus von Pflanzen ist die Entgiftung durch Konjugation - die chemische Verknüpfung einer toxischen Verbindung mit einem wasserlöslichen Molekül wie Glucose oder Glutathion. Solche neutralisierten Toxine (Konjugate) werden üblicherweise im Pflanzengewebe gespeichert. In diesem Projekt, das vom Erwin Schrödinger Programm des FWF finanziert wurde, wurden die Mechanismen und Auswirkungen der DON-Entgiftung durch von Glutathiontransferasen (GSTs) katalysierte Konjugation untersucht. GSTs sind hauptsächlich für ihre Rolle bei der Herbizid Resistenz von Nutzpflanzen bekannt, ihre allgemeinen physiologischen Funktionen in Pflanzen sind aber noch unzureichend geklärt. Ob Pflanzen-GSTs auch DON entgiften können war bisher unbekannt und wir konnten zeigen, dass Weizen-GSTs dazu in der Lage sind. Während eines zweijährigen Aufenthalts an der Universität Turku, Finnland, wurden die dreidimensionalen Strukturen solcher Enzyme mittels Röntgenkristallographie bestimmt und wir konnten zeigen, wie DON während der Katalyse im aktiven Zentrum eines solchen Enzyms gebunden ist. Ein Teil dieser Arbeit wurde in der renommierten Zeitschrift "Journal of Biological Chemistry veröffentlicht". Darüber hinaus identifizierten wir hocheffiziente, DON-entgiftende GSTs aus verschiedenen filamentösen Pilzen wie Fusarium, Aspergillus und Trichoderma. Diese Enzyme greifen spezifisch die chemische Gruppe an, die hauptsächlich für die Toxizität von DON verantwortlich ist. Die physiologische Bedeutung dieser Aktivität für Pilze ist bisher unbekannt. Genetisch veränderter Weizen, der ein solches Enzym aus dem Zellulose-abbauenden Pilz Trichoderma reesei produziert, zeigte eine hohe Resistenz sowohl gegen DON als auch gegen Fusarium-Infektion. Obwohl wir eine schnelle Bildung von DON-Glutathion Konjugaten in diesen transgenen Pflanzen beobachteten, konnten wir solche Verbindungen in reifen Weizenähren nicht nachweisen. Dies deutet darauf hin, dass die Konjugate im Laufe der Zeit vollständig weiter metabolisiert oder abgebaut werden. Wir versuchen derzeit die nachgeschalteten Metaboliten von DON-Glutathion-Konjugaten im Weizen mittels isotopenunterstützter Analyse zu identifizieren. Dieses Projekt erweitert unser Verständnis darüber, wie Pflanzen und Pilze DON neutralisieren können, erheblich. Der Nachweis, dass bestimmte Glutathiontransferasen auch erfolgreich Fusarium-Resistenz verleihen können, bedeutet einen neuen möglichen Ansatz zur nachhaltigen Züchtung widerstandsfähigerer Pflanzen und somit zur Gewährleistung von Lebensmittelsicherheit und Versorgung.