Analysis of cellular physiology of recombinant Eschericchia coli cells during synthesis of foreign protein using flow cytometry

Die Produktion rekombinanter Proteine in Bakterien gewinnt zunehmend auch großtechnisch an Bedeutung. Eines der Hauptprobleme bei der Fermentation rekombinanter Bakterien ist die Überlastung des zellulären Stoffwechsels durch die Synthese des Fremdproteins und das daraus resultierende Absterben der Zellen. Dadurch kann die Synthesekapazität der Bakterien nur für kurze Zeit genutzt werden. Um die Belastung der Bakterienzellen durch die Induktion im Detail zu charakterisieren, wurde am IAM die Methode der Flow Cytometrie etabliert. Sie ermöglicht, die Konzentration von Protein, DNA, GesamtRNA und Fremdprotein in einzelnen Zellen zu messen. Dadurch kann erstens die Verteilung eine Zelleigenschaft in einer Bakterienkultur unter verschiedenen Parametern innerhalb der Zellen erkennen. Diese Methodik soll im vorliegenden Projekt weiter verbessert werden, konkret sollen Kombinationen der bereits etablierten Bestimmungen ermöglicht werden. In weiterer Folge sollen diese Methoden dann für die Verwendung als Routinemethode zur Charakterisierung der Vorgänge in Bioreaktoren evaluiert werden. Weiters soll die Sortfunktion des Flow Cytometers genützt werden um Bakterienstämme zu selektieren, die bei hoher spezifischer Produktionsrate (hohem Gehalt an Fremdprotein bezogen auf Gesamtprotein der Zelle) trotzdem das Wachstum aufrechterhalten können. Diese Feineinstellung der Produktionsrate soll vor allem durch Mutation der Translation Initiation Region erreicht werden.