Allergenspez. Anergisierung mit pseudotypisierten Vesikel

T Lymphozyten spielen eine zentrale Rolle in der Pathogenese allergischer Erkrankungen. In der Vergangenheit konnte gezeigt werden, dass die Beeinflussung von T-Zellfunktionen zu einer Verbesserung der allergischen Krankheitssymptomatik beitragen kann. Wir planen im Rahmen dieses Projektes allergenspezifische T- Lymphozyten mittels subzellulärer Membranvesikel in einen Zustand der allergenspezifischen Unempfänglichkeit zu versetzten, um damit allergische Erkrankungen zu beeinflussen. Antigenpräsentierende Zellen, wie z. B. dendritische Zellen, produzieren konstitutiv subzelluläre Partikel, welche man Exosomen nennt. Diese Exosomen, welche unserer Meinung nach große Gemeinsamkeiten mit Virus-ähnlichen Partikeln haben, können eine Immunantwort in vivo hervorrufen. In diesem Projekt planen wir die Wertigkeit von mit Zelloberflächenrezeptoren pseudotypisierten Mikrovesikeln zu untersuchen und deren Fähigkeit zu explorieren allergen-spezifische Immunantworten zu induzieren, zu verändern oder überhaupt abzuschalten. Wir konnten vor kurzem zeigen, dass die Zusammensetzung und die Sprossung von Hüllenviren in speziellen, hydrophoben Plasmamembransabschnitten, den sog. lipid rafts, stattfindet. Wir planen nun im Rahmen dieses Projektes die Mechanismen der Virusbildung und -abschnürung als Basis für die Herstellung von Anergosomen heranzuziehen. Die induzierte Produktion von Mikrovesikeln wird durch die Expression von viralen Core Proteinen (z. B. von Moloney murine leukemia virus, HIV oder Influenza) in einer Produzentenzellinie erreicht werden. Das Pseudotypisieren von Mikrovesikeln mit relevanten Oberflächenrezeptormolekülen wird durch die rekombinante Modifikation ihrer Aminosäuresequenz erreicht werden, welche zu deren posttranslationeller Lipidmodifikation führt. Anergieerzeugende Mikrovesikel werden keine klassischen kostimulatorischen Moleküle (Liganden für Zweitsignalmolekükle) für T Lymphozyten exprimieren. Stattdessen planen wir sie mit solchen Rezeptoren zu versehen, welche T Zellmoleküle mit inhibitorischer Funktion binden können. Die Allergenspezifität der Mikrovesikel wird durch die Expression in Produzentenlinien von entsprechenden HLA Klasse II Molekülen und allergenspezifischen Peptiden/Proteinen, welche an die entsprechenden Restriktionselemente binden können, erreicht werden. Zur effizienten Anreicherung der MHC Moleküle in lipid rafts und nachfolgend in den aus ihnen entstehenden Mikrovesikeln werden wir die Moleküle mittels Sequenzen von GPI-verankerten Molekülen, dem CD4 oder dem PAG Molekül modifizieren. Die allergenspezifischen Peptide/Proteine werden mit dem N-terminus der Invarianten Kette (Ii) fusioniert werden, was zu deren Anreicherung im MIIC, dem Kompartment wo HLA Klasse II Moleküle mit Peptiden stabil beladen werden, führt. Zusätzlich sollte sich das Vorhandensein der invarianten Kette positiv auf die Anreicherung von HLA Klasse II Molekülen im MIIC auswirken. Als funktionelles Testsystem werden wir allergenspezifische T Zellen bzw. T Zell Klone von gut charakterisierten Patienten (z.B von Bet v 1 Allergikern) für unsere Studien verwenden. Unser Anergisierungssystem wird zur Gänze auf die Verabreichung von löslichen Allergenen oder Allergenpeptiden verzichten. Beide Verabreichungsformen von Allergenen können lebensbedrohliche Nebenwirkungen, wie einen anaphylaktischen Schock oder Asthma, verursachen. Unser Projekt zielt darauf ab die Wertigkeit von Anergosomen in einem allergenspezifischen Modell in vitro zu untersuchen. In daran anschließenden Studien werden wir die immunmodulatorische Relevanz von Anergosomen in in vivo Modellen explorieren.

Typ I Allergien haben in den letzten Jahrzehnten stark zugenommen was zu einer starken Beeinträchtigung der Lebensqualität vieler Menschen führt. Der enorme Anstieg von allergiebedingten Beschwerden verlangt daher nach effizienten Therapiemaßnahmen. In der Pathogenese von allergischen Erkrankungen spielen allergen-spezifische T Lymphozyten eine zentrale Rolle. Bei Allergikern kommt es durch eine massive T-Helfer 2 Antwort zur Produktion von allergie-spezifischen IgE Antikörpern. Des weiteren lösen allergen-spezifische T Lymphozyten Spät-Phase-Reaktionen und allergische Entzündungen in Zielorganen wie beispielsweise der Lunge oder der Haut aus. Im vorliegenden Projekt wurden klassische antigenpräsentierende Zellen umgangen und stattdessen neuartige, zellfreie, antigenpräsentierende Plattformen zum Einsatz gebracht, um allergen-spezifische Immunantworten zu beeinflussen. Zu diesem Zweck entwickelten wir virus-ähnliche Partikel mit immunmodulatorischen Eigenschaften, d.h. Immunosomen. Immunosomen sind Membran-Vesikel die aus der Zellmembran hervorgebracht werden können und zum überwiegenden Teil aus Lipidmikrodomänen bestehen. Die gerichtete Abschnürung von Immunosomen aus Zielzellen ist dabei durch Expression von Strukturproteinen von Hüllenviren induzierbar. Immunrezeptoren wie etwa HLA Moleküle oder immunomodulatorische Rezeptoren können dabei in den Lipidmikrodomänen der Plasmamembran in hohem Maße angereichert werden, indem ihre autochtonen Transmembrandomänen durch glykosylphosphatidylinositol-modifizierte Ankersequenzen ausgetauscht werden. Innerhalb dieses Projektes ist es uns gelungen Immunosomen mit antigenpräsentierenden Molekülen samt Helfermolekülen auszustatten und ihre funktionelle Aktivität zu untersuchen. Des weiteren haben wir die selben biochemisch analysiert und mittels Elektronenmikroskopie erfolgreich dargestellt. Um allergenspezifische Immunosomen herzustellen, haben wir die entsprechenden Restriktionselemente kloniert und die selben zunächst auf künstlichen antigenpräsentierenden Zellen und schließlich auf Immunosomen erfolgreich exprimiert. Die Modellallergene wurden dabei von uns mittels Konstrukten, welche auf der Invariante Kette von HLA Molekülen beruhen, exprimiert. Wir konnten beweisen, dass Immunosomen dazu befähigt sind, T Lymphozyten in vitro sowohl polyklonal wie auch antigenspezifisch Weise in ihrer Funktion zu modulieren. Die T Zell Aktivierung ist dabei strikt vom Vorhandensein kostimulatorischer Rezeptoren abhängig und kann durch membrangebundene Zytokine zusätzlich gesteigert werden, sie ist jedoch unabhängig von akzessorischen Zellen. Die wissenschaftlichen Erkenntnisse dieses Projektes erlauben es, die allergenspezifische Immunantwort auf der Ebene der Antigenpräsentation mit Hilfe von neuen, modulären antigenspezifischen Plattformen im Detail zu studieren und zu beeinflussen. Unsere Forschungsergebnisse stellen eine Basis für die Entwicklung neuartiger Therapieansätze zur Behandlung von Allergien und Autoimmunerkrankungen dar.