Die Bedeutung von Glycosylierung für mikrobielle Evolution

Proteinglykosylierung ist ein wichtiger Mechanismus in eukaryotischen Zellen. Sowohl in höheren als auch in niederen Organismen treten vielfache Störungen aufgrund defekter Proteinglykosylierung auf, wie zum Beispiel kompromitierte Zellteilung und Abnahme der Stressresistenz. Ein funktionierender Proteinglykosylierungsapparat kann daher als integraler Teil der regulatorischen Prozesse in eukaryotischen Zellen angesehen werden. Adaptive Laborevolution von Mikroorganismen lieferte in der Vergangenheit bedeutende Erkenntnisse für ein besseres Verständnis der molekularen Grundlage für evolutionäre Veränderungen der regulatorischen Prozesse von biologischen Netzwerken. Nichtsdestotrotz, speziell für eukaryotische Mikroorganismen, ist der Einfluss von defekten Regulationsnetzwerken, besonders in Hinblick auf Proteinglykosylierung, auf die Fähigkeit der evolutionären Anpassung wenig erforscht. Um einen tieferen Einblick in diese Dynamik zu erhalten, wird mit der biotechnologisch relevanten Hefe Pichia pastoris als Modellorganismus, die Bedeutung von Proteinglykosierung und Stressadaption näher untersucht. Die Laborevolution von Wildtypstämmen und Glykosylierungsmutanten in Stress- und Kontrollbedingungen soll dabei Aufschluss über die evolutionäre Flexibilität von Genregulationsnetzwerken geben. Durch die Analyse eines unkonventionellen Modellorganismus und eine systembiologische Untersuchung der adaptierten Hefestämme sollen erweiterte Erkenntnisse über die generellen Mechanismen molekularer Evolution gewonnen werden. Weiters werden dadurch neue Ansätze für zukünftige Forschung an biotechnologisch und medizinisch relevanten Mikroorganismen, wie zum Beispiel verbesserte Computermodelle von zellulären Systemen, ermöglicht werden.

Im Projekt Die Bedeutung von Glykosylierung für die mikrobielle Evolution wurden die Auswirkungen von Defiziten der zellulären Glykoyslierungsmaschinerie in Mikroorganismen auf die Evolution im Labormaßstab untersucht. Dabei wurde die industrielle Hefe Pichia pastoris als Modellorganismus gewählt. Es konnte ein geeignetes experimentelles Setup etabliert werden um die Auswirkungen von Defekten der Glykosylierung in verschiedenen Kontroll- und Stressbedingungen zu untersuchen. Pichia pastoris-Kulturen wurden für mehrere hundert Generationen gezüchtet und in weiterer Folge mit den verschiedensten Methoden in Hinblick auf Wachstumsunterschiede und auf der Ebene des Erbguts untersucht. Aus der Auswertung der Daten konnten wichtige Erkenntnisse in Bezug auf die Molekularbiologie von Pichia pastoris und Hefen im Allgemeinen gewonnen werden. Die Ergebnisse stützen die dem Projekt zugrunde liegende Hypothese, dass die Beeinträchtigung der zellulären Glykosylierung die Anpassung an bestimmte Umweltbedingungen beeinflusst. Zu einem zeigten Populationen einer Glykosylierungsmutante ein verringertes Maß an Anpassung als die Populationen eines Kontrollstammes. Zum anderen konnte durch die Analyse des Erbguts Mutationen, die sowohl spezifisch für bestimmte Umweltbedingungen als auch spezifisch für die Glykosylierungsmutante sind, identifiziert werden. Es konnten mehrere Mutationen, die eine potentielle Rolle bei der Anpassung an spezifische Wachstumsbedingungen spielen, identifiziert werden, wobei in Hinblick auf die betroffenen Gene ein hohes Maß an Rekursion beobachtet wurde. Die Ergebnisse deuten auf stammspezifische Inkompatibilität dieser Mutationen hin. Durch detaillierte Analyse konnten anhand der Lokalisierung der Mutationen speziesspezifische Transkriptionsfaktoren, mit offenbarer Schlüsselrolle in der Umweltanpassung von Pichia pastoris, identifiziert werden. Durch den Vergleich mit ähnlichen Studien konnten wichtige Erkenntnisse in Bezug auf Ähnlichkeiten mit der Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, gewonnen werden. Zu guter Letzt wurden Gene identifiziert, die eine wichtige Rolle für effizientes Wachstum auf der Kohlenstoffquelle Methanol spielen. In diesem Zusammenhang wurde der Nutzen einzelner Stämme nach Langzeitselektion für die Produktion von verschiedenen rekombinanten Proteinen evaluiert. Gewisse Stämme zeigten dabei eine erhöhte Produktivität in verschiedenen Produktionsmaßstäben. Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass das Konzept der Laborevolution erfolgreich für Pichia pastoris angewendet werden kann um neue Kenntnisse in Hinsicht auf biotechnologische Anwendungen zu gewinnen.