Analyse der Prozessierung von Thionin Proproteinen in Arabidopsis

Antimikrobielle Peptide sind ein wichtiger Bestandteil des Immunsystems in Tieren und Pflanzen. Eine Gruppe von Pflanzen-spezifischen antimikrobiellen Peptiden sind die Thionine welche durch 3 oder 4 Disulfidbrücken stabilisiert werden. Sie werden zunächst als Präproproteine produziert welche aus einem Signalpeptid, dem eigentlichen Thionin und einer sogenannten sauren Domäne bestehen. Die reifen Thionine wurden in Zellwänden, Vakuolen und Proteinkörpern gefunden. Um die saure Domäne zu entfernen ist ein Thionin Proprotein Prozessierendes Enzym (TPPE) notwendig. In einem vorangegangenen FWF Projekt wurde solch ein TPPE aus Gerste isoliert und als eine Subtilase identifiziert. Ein Gersten Thionin Proprotein wurde von dem rekombinanten TPPE korrekt prozessiert. Dabei wurde die saure Domäne an mehreren Stellen gespalten. Dies erklärt, warum ein der sauren Domäne entsprechendes Protein niemals aus Pflanzen isoliert wurde. Das Thionin selbst war durch seine dreidimensionale Struktur, welche durch die Disulfidbrücken stabilisiert wird, vor dem TPPE geschützt. In dem hier vorgestellten Projekt wird vorgeschlagen, diese Ergebnisse in der Pflanze zu bestätigen. Hierzu wäre Arabidopsis viel geeigneter als Gerste. Arabidopsis hat 4 Thioningene und eine Subtilase (AtSbt1.4) mit Homologie zum von uns isolierten Gersten TPPE. Die Arabidopsis Subtilase AtSbt1.4 und 2 verwandte Enzyme (AtSbt1.2 und AtSbt1.7) wurden bereits in einem Expressionsvektor kloniert, ebenso alle 4 Arabidopsis Thionin Proproteine. Die Prozessierung dieser Proproteine soll zunächst in vitro analysiert werden. Anschliessend würde die Prozessierung in Arabidopsis Keimlingen untersucht werden. Es würden weiter auch transgene Pflanzen erzeugt werden, welche mit einem kurzen Peptid- Marker versehene Proproteine produzieren. In Summe sollten diese Ergebnisse die Subtilase AtSbt1.4 als TPPE bestätigen. Weiters ist geplant, die Anforderungen an die Proteinsequenz zwischen Thionin und saurer Domäne zu untersuchen. Dies würde vor allem mit einer Reihe unterschiedlicher Peptide geschehen. Diese würden mit rekombinanter AtSbt1.4 inkubiert und die Spaltung anschliessend mit Massenspektrometrie untersucht. Ausserdem wird vorgeschlagen, die Lokalisierung der TPPE in der Zelle mit Hilfe von Antikörpern und GFP zu untersuchen. Wie viele pflanzliche Subtilasen enthält auch AtSbt1.4 eine PA Domäne und eine C-terminale Domäne über deren Funktion nicht viel bekannt ist. Es sollen deshalb AtSbt1.4 Mutanten erzeugt werden und deren Effekt auf die Prozessierung von Proproteinen untersucht werden. Ausserdem würde getestet werden, inwieweit diese beiden Domänen für die Lokalisierung des Enzyms innerhalb der Zelle wichtig sind.

Thionine sind antimikrobielle Peptide aus Pflanzen. Sie werden als Präproproteine produziert und dann zu den meist basischen Thioninen mit 3 oder 4 Disulfidbrücken prozessiert. Wir haben kürzlich ein Thionin Proprotein Prozessierendes Enzym (TPPE) aus Gerste isoliert. Diese Sequenz benutzten wir um ein Arabidopsis TPPE als Subtilase Sbt1.4 zu identifizieren. Wir haben alle 4 Arabidopsis Proproteine, ein Viscotoxin Proprotein and ein Gersten Blatt-Thionin Proprotein in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Das Arabidopsis TPPE wurde ebenfalls in E. coli exprimiert. Im Gegensatz zum Gersten TPPE konnte das Arabidopsis TPPE allerdings nur geringfügig induziert werden und wir konnten nur eine geringe Menge von Arabidopsis TPPE von geringer Reinheit isolieren. Wir testeten das Enzym mit allen Proproteinen in vitro. Alle wurden prozessiert wie mit Gel Elektrophorese gezeigt werden konnte. Eine genauere Analyse mit Massen Spektroskopie ist noch ausstehend. Expression des Arabidopsis TPPE wurde mit einer Promotor::GUS Fusion untersucht. Eine Blaufärbung war in jungen Keimlingen zu beobachten und war besonders im Hypokotyl sehr stark. In Wurzeln war die Expression nur sehr schwach. Färbung wurde in allen Blättern beobachtet, besonders an der Basis von Trichomen und um Spaltöffnungen. Auch in Blüten und Schoten gab es Expression. Diese Beobachtungen sind in Übereinstimmung mit der bekannten Expression der 4 Thionin Gene. Eine wichtige Frage war ob die Subtilase Sbt1.4 das einzige Arabidopsis TPPE ist. Wir produzierten deshalb homozygote transgene Linien im Wildtyp und in der At3g14067 Mutante mit einem FLAG getaggten Thi2.4 Proprotein. Western Blots wurden mit einem Anti-FLAG Antikörper beprobt um das getaggte Thi2.4 Proprotein zu detektieren. Das unprozessierte Proprotein wurde in der Mutante gefunden. Western Blots mit einem Thi2.4 Antikörper konnten das reife Thi2.4 Peptid in Wildtyp Extrakten nachweisen. Aus diesen Ergebnissen schliessen wir dass Sbt1.4 das einzige TPPE in Arabidopsis für Thi2.4 ist. Allerdings können wir nicht ausschliessen dass es weitere TPPEs für die anderen Arabidopsis Thionine gibt. Im Laufe dieses Projektes erhielten wir Zugriff auf die Daten der "One Thousand Plant Transcriptomes Initiative" (1KP Projekt) mit den Transkriptom Sequenzen von über 1000 Pflanzen Spezies. Diese neuen Daten führten zu einer Revision der Thionin Klassifizierung. Nun teilen wir die Thionine nur noch in 2 Klassen ein, Klasse 1 mit 8 Zysteinen und Klasse 2 mit 6 Zysteinen. Die verschiedenen schon bekannten und neu gefundenen Varianten lassen sich alle auf diese beiden Klassen zurückführen.